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microRNA（miRNA）广泛存在于真核生物中,是一类具有保守性、时序性和组织特异性的小分子,其主要通过对靶基因转录后调控影响生物体的生理过程。其中,细胞凋亡作为机体的正常生理现象,是一种受基因精准调控的自主有序的细胞死亡方式,贯穿多细胞生物的整个生命活动过程,对内环境的稳态具有重要作用。目前,miRNA在细胞凋亡中的调控机理是生命科学研究的热点之一。家蚕（Bombyx mori）作为鳞翅目的模式生物代表,关于其miRNA在细胞凋亡过程中的功能及调控机制的研究还有待丰富。鉴于此,本研究对家蚕细胞凋亡模型进行高通量测序（High-throughput sequencing,Hiseq）及生物信息学分析,鉴定细胞凋亡相关miRNA,对其在调控细胞凋亡过程中的功能进行研究,并通过寻找miRNA的靶基因,探究家蚕miRNA调控细胞凋亡的机制。本研究可为家蚕miRNA参与细胞凋亡的机制研究和完善家蚕细胞凋亡调控网络奠定基础,对解析其参与的各种生物学过程有着重要意义。主要研究结果和结论如下:1.家蚕细胞凋亡相关miRNAs的筛选与鉴定Bmiap是家蚕线粒体凋亡通路的关键抑凋亡因子,前期本课题组已通过敲除Bmiap基因诱导BmE细胞凋亡。为了筛选家蚕细胞凋亡相关的miRNAs,本研究对正常BmE-SWU1细胞（Control组）和敲除Bmiap基因的BmE-SWU1细胞样品（KO组）进行了miRNA测序。对测序得到的s RNAs进行长度筛选、参考基因组比对、二级结构及Dicer酶切位点分析,共鉴定到651个miRNAs,其中已知的miRNAs为499个,未知的miRNAs为152个。对上述miRNAs进行差异表达分析,获得受敲除Bmiap基因影响的差异表达miRNAs共有8个,其中3个上调,5个下调。利用茎环（stem-loop）qRT-PCR对差异miRNAs进行表达量分析,结果显示有7个miRNAs的表达水平均与转录组趋势一致。以上结果表明,从转录组数据中鉴定到的7个差异表达miRNAs较为可靠,可进行后续研究。对差异miRNAs的靶基因进行预测和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and genomes）通路富集,这些靶基因主要富集到了16条信号通路上。其中,靶基因富集到凋亡通路的miRNAs有3个（miR-13a-5p、miR-3373-3p和novel-53）,靶基因分别为BmE93、BmBr-c和BmE74,暗示三者可能在细胞凋亡中发挥功能。为了探究miRNAs对细胞凋亡的影响,本研究成功构建miR-13a-5p、miR-3373-3p和novel-53过表达载体,在细胞水平过表达miRNA后进行Caspase3/7酶活性检测。结果显示,过表达miR-3373-3p导致酶活性下降,抑制细胞凋亡的发生;过表达miR-13a-5p导致酶活性上升,促进细胞凋亡的发生;过表达novel-53后Caspase3/7酶活性无变化。其中miR-3373-3p对细胞凋亡的影响最为显著,故以miR-3373-3p为研究对象进行后续研究。2.家蚕miR-3373-3p对细胞凋亡的分析为了分析miR-3373-3p的组织表达特征,本研究通过stem-loop qRT-PCR对miR-3373-3p的表达水平进行分析,结果显示,miR-3373-3p在大造5L3D的精巢中转录水平最高,头部转录水平最低。为了进一步探究miR-3373-3p在细胞凋亡中的作用,本研究在BmE-SWU1中分别转染Bmiap-KO-miR-3373-3p-OE载体和添加miR-3373-3p inhibitor,利用TUNEL染色、Caspase3/7酶活性检测和流式细胞术进行细胞凋亡情况分析。结果显示,过表达miR-3373-3p能够明显减少敲除Bmiap基因所导致的细胞凋亡发生,Caspase3/7酶活性和细胞凋亡比率降低,表明miR-3373-3p对细胞凋亡有抑制作用。添加miR-3373-3p inhibitor能够明显促进细胞凋亡的发生,使Caspase3/7酶活性和细胞凋亡比率显著升高。由此说明miR-3373-3p具有抑制细胞凋亡的作用。对线粒体凋亡通路关键基因的定量结果显示,转染Bmiap-KO-miR-3373-3p-OE载体后,线粒体凋亡通路中的抑凋亡基因BmBuffy表达量显著升高,促凋亡基因BmDronc、BmICE表达量显著降低;添加miR-3373-3p inhibitor后BmBuffy基因的转录水平无显著变化,BmDronc基因和BmICE基因的转录水平显著上升。综上所述,miR-3373-3p对细胞凋亡具有抑制作用,且参与线粒体凋亡通路的调控。3.家蚕miR-3373-3p靶基因的鉴定及功能研究为了探究miR-3373-3p对细胞凋亡的作用机制,本研究首先通过qRT-PCR分析miR-3373-3p对其在细胞凋亡通路上的候选靶基因BmBr-c（Bombyx mori Broad complex）基因转录水平的影响。细胞水平过表达miR-3373-3p后,BmBrc基因的表达量下调;添加miR-3373-3p inhibitor后,BmBr-c基因的表达量上调,表明miR-3373-3p与BmBr-c基因的表达量呈负相关。因此,miR-3373-3p对BmBr-c基因具有负调控作用。为了进一步探究miR-3373-3p与靶基因BmBr-c基因的调控机制,本研究对两者间的结合位点进行分析。利用双荧光素酶报告基因检测发现,miR-3373-3p及其inhibitor能使包含BmBr-c野生型3’UTR结合位点的相对荧光强度变化;miR-3373-3p对包含BmBr-c突变型3’UTR结合位点的相对荧光强度无影响,表明miR-3373-3p的确特异性靶向BmBr-c基因。为了进一步分析BmBr-c基因在细胞凋亡中的调控作用,首先对BmBr-c基因的时空表达特征进行分析,发现BmBr-c基因在大造5L3D的卵巢、中肠、脂肪体和血液中高表达,在吐丝2天高量表达,其余时期表达量相对较低。随后构建了BmBr-c基因的过表达和干涉载体。过表达和干涉BmBr-c基因后,采用Caspase3/7酶活性和流式细胞术检测BmBr-c对细胞凋亡的影响。过表达BmBr-c基因后,促进细胞凋亡的发生;干涉BmBr-c基因后,细胞凋亡受到抑制,表明BmBr-c基因对细胞凋亡有促进作用。对线粒体凋亡通路关键基因的定量结果显示,过表达BmBr-c后,线粒体凋亡通路中的抑凋亡基因BmBuffy表达量显著下调,促凋亡基因BmDronc、BmICE表达量显著上调;干涉BmBr-c后,BmBuffy的转录水平显著上调,BmDronc和BmICE的转录水平显著下调。上述结果表明,BmBr-c基因促进细胞凋亡发生,且参与线粒体凋亡通路的调控。以上研究结果表明,家蚕miR-3373-3p可通过下调靶基因BmBr-c的表达水平,通过线粒体通路对细胞凋亡发挥抑制作用。