【摘 要】
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种桑养蚕在我国有悠久的历史,该产业一直都在我国农业经济中占有较大比重。家蚕（Bombyx mori）经济作用的存在主要源于家蚕丝腺,该器官是家蚕大量合成丝蛋白来吐丝营茧的场所。随着家蚕基因组图谱的绘制完成,家蚕丝腺蚕丝蛋白的化学组成结构与合成分泌机理也被进一步研究。近年来,以家蚕丝腺为核心的生物反应器的遗传改良工艺技术得到进一步发展,成功地生产出了许多富有生物学活性的功能性外源蛋白,并衍生出将蚕丝
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种桑养蚕在我国有悠久的历史,该产业一直都在我国农业经济中占有较大比重。家蚕（Bombyx mori）经济作用的存在主要源于家蚕丝腺,该器官是家蚕大量合成丝蛋白来吐丝营茧的场所。随着家蚕基因组图谱的绘制完成,家蚕丝腺蚕丝蛋白的化学组成结构与合成分泌机理也被进一步研究。近年来,以家蚕丝腺为核心的生物反应器的遗传改良工艺技术得到进一步发展,成功地生产出了许多富有生物学活性的功能性外源蛋白,并衍生出将蚕丝蛋白与丝腺表达外源蛋白相结合构建功能型蚕丝的新研究方向,这不仅为蚕桑产业带来了新方向,也扩展了蚕丝的应用领域。为了更好利用家蚕丝腺生物反应器,本研究在丝腺中重组表达了具有生物活性的人源神经营养因子-4（Human neurotrophic factor-4,NT-4）,创制出了具有促细胞黏附与增殖分化作用的新型蚕丝水凝胶。主要研究结果如下:1.家蚕丝腺表达NT-4家蚕品系的获得与分子检测NT-4是神经营养因子家族的一员,在生物体发育过程中具有调控神经元的生长和生存,并维持成年神经元存活,促进受损轴突损伤后再生等功能。本研究通过人工合成NT-4基因并构建在家蚕丝腺中、后部特异性表达NT-4蛋白的转基因载体,将这两种载体显微注射入家蚕胚胎中,通过荧光筛选得到转基因品系;基因组PCR与实时荧光定量结果表明,NT-4基因己成功插入家蚕基因组当中并发生转录;WB实验成功检测到重组蛋白的表达;将转基因家蚕与872实用种杂交,获得的杂交蚕茧中外源蛋白表达量提高了两倍。2.转基因家蚕蚕茧中NT-4蛋白的生物活性检测NT-4蛋白具有促进神经细胞增殖与调节细胞分化的活性,为了验证家蚕表达NT-4蛋白的生物活性,对转基因蚕茧中NT-4蛋白进行提取及蛋白活性检测。研究结果显示:采用表达NT-4蛋白的家蚕蚕茧提取液培养新鲜取材获得的鸡胚背根神经节（DRG）24 h,与野生型蚕茧提取液相比,重组NT-4蛋白可以有效促进DRG细胞向外迁出;NT-4家蚕蚕茧提取液培养小鼠海马神经元前体细胞（HT22细胞）48 h,与对照组相比,重组蛋白NT-4可以有效促进HT22细胞向神经类细胞分化,以及促进髓鞘相关基因的表达;另外进行CCK-8细胞增殖检测与Ed U染色实验,结果表明NT-4能够有效促进HT22细胞增殖。3.家蚕表达NT-4蚕丝材料的构建与功能研究神经干细胞等神经类细胞在体外培养时会出现细胞增殖活性低、细胞黏附性差等问题,而NT-4蛋白可促进神经细胞增殖以及蚕丝蛋白可增加细胞黏附性,本研究将二者结合起来构建功能性蚕丝材料。研究结果显示:通过提取上蔟期家蚕丝腺腔内容物,溶解内容物获得丝素-丝胶再生溶液,并在4℃静置形成自组装水凝胶,将HT22细胞接种于丝素-丝胶水凝胶上培养,与普通细胞培养板相比,丝素-丝胶水凝胶可有效促进HT22细胞黏附;利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,结果显示,含NT-4蛋白的水凝胶可以促进HT22细胞增殖;Q-PCR检测HT22细胞髓鞘相关基因,含NT-4蛋白水凝胶显著上调HT22细胞髓鞘相关基因表达,表明含NT-4蛋白蚕丝材料可促进细胞分化。综上所述,本研究通过利用本实验室现有家蚕转基因技术与丝腺表达系统,构建出可以在中、后部丝腺表达具有生物活性NT-4蛋白的转基因家蚕品系,通过直接利用家蚕丝腺腔内容物提取获得含NT-4蛋白的蚕丝溶液,构建了可促进HT22细胞增殖、分化的丝素-丝胶自组装水凝胶。合理利用与改进该新型蚕丝材料,有望低成本制备促进神经类细胞增殖与神经损伤修复的再生蚕丝材料,从而应用于神经组织工程领域,具有较大应用价值。
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