【摘 要】
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糖尿病是能量代谢紊乱疾病,引起骨丢失加重疾病负担,影响患者生活质量。当前关于糖尿病致骨丢失的治疗和普通骨质疏松症治疗类似,但存在药物副作用和长期治疗效果不明确等问题,确保药物安全性以改善患者生活品质并探索糖尿病致骨丢失机制很有必要。为了研究细胞经过高糖处理后的代谢、增殖和成骨分化情况,我们在体外建立细胞模型,分别使用含正常浓度葡萄糖(5.6m M)、高浓度葡萄糖(25m M)的α-MEM完全培养基
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糖尿病是能量代谢紊乱疾病,引起骨丢失加重疾病负担,影响患者生活质量。当前关于糖尿病致骨丢失的治疗和普通骨质疏松症治疗类似,但存在药物副作用和长期治疗效果不明确等问题,确保药物安全性以改善患者生活品质并探索糖尿病致骨丢失机制很有必要。为了研究细胞经过高糖处理后的代谢、增殖和成骨分化情况,我们在体外建立细胞模型,分别使用含正常浓度葡萄糖(5.6m M)、高浓度葡萄糖(25m M)的α-MEM完全培养基和成骨培养基(OS medium)诱导细胞,并探索淫羊藿苷(Icariin,ICA)对高糖致骨丢失的治疗效果及相关分子机制。结果如下:○1 CCK-8和Ki67免疫荧光(Immunofluorecsence,IF)实验均证实高浓度葡萄糖促进MC3T3-E1增殖(P<0.01)。○2茜素红染色显示高浓度葡萄糖显著抑制MC3T3-E1细胞矿化结节形成(P<0.001)。ELISA、Western blot结果分别显示高浓度葡萄糖显著抑制ALP活性(P<0.01),并抑制ALP、OPN蛋白表达(P<0.001);通过IF和Western blot均发现Ac-α-tubulin和γ-tubulin表达显著降低(P<0.05),证实高浓度葡萄糖抑制原纤毛生长;Western blot结果显示高浓度葡萄糖显著抑制GYS1(P<0.01)、IHH、SHH、Gli2、Glut4、PFKM和ACACA(P<0.001)表达,促进PYGL(P<0.05)和PDP1(P<0.001)表达,而未对DHH、Gli1表达产生明显影响(P>0.05)。○3通过在高糖培养基中添加ICA,茜素红染色结果显示三种成骨细胞(MC3T3-E1、BMSC、primary OB)矿化结节形成得到显著增加(P<0.05),ALP活性和成骨分化标志蛋白COLⅠ、OPN蛋白表达显著增加(P<0.05),证实ICA能有效缓解高浓度葡萄糖导致的成骨细胞分化和矿化抑制。○4在高糖培养基中添加ICA,Western blot结果显示,Ac-α-tubulin、γ-tubulin、SHH、Gli2蛋白表达被显著增加(P<0.01),而Ptch1、Sufu蛋白表达显著降低(P<0.01);IF证实ICA能促进高糖环境下原纤毛生长,并维持Gli2与Ac-α-tubulin共定位。○5Mito-Tracker Green荧光结果证实高糖显著抑制3种成骨细胞线粒体活性(P<0.001),Western blot结果也显示线粒体标志蛋白PGC-1α、NFR1、TFAM表达被抑制(P<0.01),加入ICA能有效增加线粒体活性并缓解蛋白表达抑制(P<0.01);DCFH-DA探针检测结果证实高糖导致成骨细胞中ROS大量生成,Mito Tempo和ICA均能发挥ROS清除剂的作用(P<0.05)。以上结果证实,高浓度葡萄糖虽然一定程度上能促进MC3T3-E1细胞增殖,但却损害细胞的葡萄糖和糖原代谢,并通过破坏原纤毛稳态引起Hedgehog信号障碍导致成骨分化、矿化受损。ICA抑制高糖环境下线粒体ROS过量产生来保护原纤毛,完整原纤毛是Gli2转录后修饰及成熟位点,从而通过Shh/Gli2途径激活Hedgehog信号促进成骨分化和矿化,挽救高糖致骨丢失。提示控制血糖浓度和保护成骨细胞原纤毛可能是治疗糖尿病致骨丢失的一种新方案。
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