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目的通过构建靶向间皮素（mesothelin,MSLN）的CAR-T细胞,在体外验证其靶向杀伤PANC-1和Aspc-1胰腺癌细胞的能力以及猪苓多糖（PPS）、人参多糖（GPS）、黄芪多糖（APS）、香菇多糖（LNT）和灵芝多糖（GLP）等调节免疫药物对CAR-T细胞增殖及其杀伤肿瘤效应的影响。另外建立NOG高度免疫缺陷小鼠Aspc-1细胞移植瘤模型,观察靶向间皮素的CAR-T细胞在体内抑制Aspc-1细胞移植瘤的有效性,为后期深入研究提供依据。方法1.将含MSLN抗体scFv片段的CAR序列插入慢病毒质粒中,包被慢病毒。用酶切质粒电泳,检测目的基因正确性;利用倍比稀释后的慢病毒感染HEK293T细胞,然后利用细胞阳性率计算病毒滴度;按MOI值=100添加相应慢病毒体积,通过慢病毒感染的方式制备meso-CAR-T细胞（感染体系:2×105/mLT细胞、病毒、促感染试剂trans P）;通过流式细胞术检测meso-CAR-T细胞的阳性率并进行分选;然后通过qPCR、Western blot先后验证分选后T细胞中CAR序列的表达,流式细胞术检测meso-CAR-T细胞的阳性率。2.通过qPCR、Western blot验证胰腺癌Aspc-1细胞和PANC-1细胞中表面抗原MSLN（rMSLN）的阳性表达,并用qPCR检测胰腺癌MIA细胞中rMSLN蛋白的相对表达;利用MIA和PANC-1细胞提供MSLN抗原刺激meso-CAR-T细胞,采用CCK-8法评估其扩增速度;然后采用LDH释放法、实时无标记细胞（RTCA）分析法和萤火虫荧光素酶法分别检测meso-CAR-T细胞、普通jurkat细胞对两种胰腺癌细胞的杀伤作用;采用CCK8、RTCA检测猪苓多糖（PPS）、人参多糖（GPS）、黄芪多糖（APS）、香菇多糖（LNT）和灵芝多糖（GLP）对CAR-T细胞杀伤胰腺癌Aspc-1细胞效率的影响。3.将Aspc-1胰腺癌细胞按5×106/只的数量腹侧皮下注射到NOG高度免疫缺陷小鼠体内,小鼠成瘤后分别给予meso-CAR-T细胞、普通jurkat细胞和PBS三种治疗。通过肿瘤体积、重量测量评估meso-CAR-T细胞于体内对胰腺癌的抑制作用。然后剥离瘤体,通过免疫组化的方式检验T细胞对肿瘤的浸润;通过qPCR法检测小鼠眼球血中CAR-T细胞生存增殖情况。结果1.成功合成三代MSLN-CAR慢病毒重组质粒,经酶切后监测电泳条带,结果提示条带位置符合理论值;基因测序结果符合原设计序列,并成功包装慢病毒;qPCR、Western blot结果显示:CAR分子存在于慢病毒感染后的jurkat细胞中,meso-CAR-T细胞构建成功;流式细胞术测得分选后meso-CAR-T细胞阳性率可达55.8%。2.经Western blot验证胰腺癌Aspc-1细胞和PANC-1细胞表面MSLN抗原（rMSLN）蛋白均有表达,且Aspc-1细胞表面rMSLN蛋白表达量明显高于PANC-1细胞（p＜0.05）;qPCR检验结果显示MIA、PANC-1、Aspc-1细胞表面均有rMSLN蛋白表达,但MIA细胞表面目的蛋白相对表达量较低,而PANC-1、Aspc-1细胞表面rMSLN蛋白表达相对量较高,尤其是Aspc-1细胞表面目的蛋白的相对表达量是MIA细胞的70倍;CCK-8检测CAR-T细胞增殖结果提示,在靶抗原表达量较多的PANC-1细胞的刺激下meso-CAR-T细胞的增殖数量较MIA细胞组上升更快（p＜0.05）;LDH细胞毒性、RTCA以及萤火虫荧光素酶等体外实验检测均显示,meso-CAR-T细胞的抗肿瘤作用随效靶比的提高而增强。当效靶比为8:1时,meso-CAR-T细胞对PANC-1、Aspc-1两种胰腺癌细胞杀伤效率最高,杀伤率分别达到40.72%和23.15%,meso-CAR-T细胞对rMSLN蛋白高表达的Aspc-1细胞杀伤率明显高于蛋白低表达的PANC-1细胞;CCK8法测试结果显示,与对照组相比0.156mg/ml的GLP和0.625mg/ml的LNT对CAR-T细胞增殖有一定的促进作用;但是RTCA仪器检测结果显示,在效靶比4:1的情况下0.156mg/ml的GLP和0.625mg/ml的LNT对CAR-T细胞杀伤Aspc-1肿瘤细胞几乎没有影响。3.在体内实验中,与对照组相比,注射meso-CAR-T细胞的实验组小鼠皮下肿瘤组织并未受到抑制,剥离的三组小鼠肿瘤组织块在体积、重量方面没有显著差别（p＞0.05）;小鼠眼球取血经qPCR检测结果提示,三组小鼠全血内CAR-T基因扩增曲线呈水平趋势,小鼠全血内没有检测到CAR-T细胞;各组肿瘤组织靶向CD3阳性免疫组化结果显示,实验组T细胞阳性表达低于空白组和对照组。结论通过慢病毒转染,成功构建了能稳定表达三代CAR序列的meso-CAR-T细胞。在体外实验中,与普通jurkat细胞组相比,meso-CAR-T细胞能有效杀伤rMSLN阳性的PANC-1、Aspc-1两种胰腺癌细胞,杀伤效率与效靶比呈正相关,且癌细胞表面rMSLN阳性蛋白表达量越高的细胞杀伤效率越高。另外0.156mg/ml的GLP和0.625mg/ml的LNT对CAR-T细胞增殖有一定的刺激作用,虽然对CAR-T细胞杀伤Aspc-1肿瘤细胞几乎没有影响,但是在临床应用中可用来调节患者机体增强免疫力。体内实验表明以jurkat细胞为载体构建的meso-CAR-T细胞对Aspc-1皮下移植瘤的生长无抑制作用,且小鼠全血经qPCR检测、肿瘤组织免疫组化染色都表明CAR-T细胞被小鼠自身代谢,无法抑制肿瘤增殖。