【摘 要】
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鸽（Columba livia）作为人类较早驯化的鸟类之一,在世界各地被广泛饲养。鸽在我国已成为鸡、鸭、鹅之后的第四大家禽。鸽作为晚成鸟,与其他家禽相比,鸽具有早期生长发育快的特点,刚出壳时只有约20g,而正常发育到28天后,体重可达到500克以上,是出壳时的25倍,远快于其他家禽,其快速生长的机理仍未完全阐明。骨骼肌发育是一个复杂的生物学过程,包括骨骼肌卫星细胞、成肌细胞、肌管和肌纤维四个阶段,
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鸽（Columba livia）作为人类较早驯化的鸟类之一,在世界各地被广泛饲养。鸽在我国已成为鸡、鸭、鹅之后的第四大家禽。鸽作为晚成鸟,与其他家禽相比,鸽具有早期生长发育快的特点,刚出壳时只有约20g,而正常发育到28天后,体重可达到500克以上,是出壳时的25倍,远快于其他家禽,其快速生长的机理仍未完全阐明。骨骼肌发育是一个复杂的生物学过程,包括骨骼肌卫星细胞、成肌细胞、肌管和肌纤维四个阶段,有大量调控因子参与其中,包括miRNA。Micro RNA（miRNAs）是广泛存在于动植物体内的单链小分子非编码RNA,通过识别并结合靶基因3’UTR从而抑制靶基因的表达。迄今为止,参与鸽骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的miRNAs尚不清楚。本试验中我们分离、培养鸽原代骨骼肌卫星细胞并通过免疫荧光和RT-q PCR方法鉴定。对分化前后的骨骼肌卫星细胞进行micro RNA测序,以期鉴定并筛选出可能参与鸽骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的重要miRNA。使用Targetscan和RNAhybrid预测与其具有直接靶标关系的靶基因;并通过双荧光素酶报告系统进行验证。最后我们在鸽原代骨骼肌卫星细胞中通过对两种miRNAs进行功能验证。研究结果如下:1.建立了鸽原代骨骼肌卫星细胞分离、培养体系,通过免疫荧光染色及RT-q PCR技术鉴定了所分离的细胞为鸽原代骨骼肌卫星细胞;发现在未使用马血清或血清剥夺等条件诱导分化的情况下,骨骼肌卫星细胞约在培养第三天开始形成肌管,至第五天有大量肌管生成。2.使用CCK-8试剂盒对分离的鸽原代骨骼肌卫星细胞进行生长曲线的绘制,结果显示鸽骨骼肌卫星细胞的生长曲线呈“S”形,其中1-3天为潜伏期,细胞增殖缓慢,3-5天为对数增长期,第5天细胞数达到最大,第6天细胞发生接触抑制。3.分化前后鸽骨骼肌卫星细胞通过高通量测序结合生物信息学分析共鉴定出689个成熟miRNA,其中包括297个已知的miRNA,261个保守的miRNA和131个新miRNA,为鸽miRNA信息资源进行了大量补充。共筛选出75个差异表达miRNA;其中23个miRNAs上调,52个下调。功能富集分析结果显示这些miRNAs对应的靶基因主要参与生物调节、发育进程等生物学过程。4.双荧光素酶报告系统结果显示miR-181a-5p可与Mef2a的3’UTR区靶向结合;miR-20b-5p可与Smad7的3’UTR区靶向结合。5.功能试验结果表明,过表达和抑制miR-181a-5p,可分别抑制和促进肌管生成。RT-q PCR结果显示抑制miR-181a-5p可促进肌增强因子Mef2a及MyOG等成肌分化标志基因的表达。（p＜0.05）。6.过表达和抑制miR-20b-5p可分别抑制和促进肌管生成。转染miR-20b-5p inhibitor后鸽骨骼肌卫星细胞中Smad7表达显著下调。（p＜0.05）。综上所述,我们建立了鸽原代骨骼肌卫星细胞分离、培养体系,并通过miRNA测序分析和功能验证,初步探索了鸽肌肉生成过程中miRNA的作用机制。该成果丰富了鸽肌肉发育的研究手段,为探索鸽肌肉发育的规律,促进肉鸽生产提供一定的理论依据和数据来源。
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