miRNA是一种长度为20–24nt的单链RNA小分子，它们是一类基因转录后调控的调控器。自从miRNA在动物和人类体内的调控作用被确认以后，便引起了人们对它的特别关注,因为它对生物功能的发展，细胞增殖和分化，以及凋亡和代谢等都具有关键的调控影响。目前检测miRNA的技术有很多，主要有几种方法：微阵列、Northern印迹杂交、实时荧光定量PCR法和克隆测序法。但最常用和最灵敏的miRNA检测技术为茎-环状引物反转录检测法（RT-PCR），该技术是由Chen等将反转录定量PCR技术引入到miRNA的检测当中所建立的,这种茎环结构大大提高了反转录的效率和特异性。如今虽然关于茎-环RT-PCR的相关试验的研究报道很多，但是研究其逆转录茎环引物的茎部结构和环部结构分别对试验中检测样本的灵敏度影响的报道极少。本实验运用茎-环状引物反转录检测法（RT-PCR）构建一个高效且特异性的逆转录茎环引物，以准确定量检测小鼠的miRNA-505基因，同时探讨茎环引物的结构对逆转录效率的影响。主要方法:以miRNA-505基因序列为模板，通过改变通用茎环引物来设计该基因的特异性逆转录引物.具体步骤：将通用茎环引物先保持茎部碱基对的数目不变，再梯度改变环部的碱基个数，经过SYBR-GreenⅠ实时Q-PCR检测可以判断哪个组合的逆转录效率最佳，从而得知引物环部结构对逆转录效率的影响。然后以最佳环部结构作为基础，再梯度改变茎部碱基对的数目，经过后续Q-PCR检测即可以判断出miRNA-505基因茎环引物的最佳茎部碱基的结构和环部结构的组合，从而也得知引物茎部结构对逆转录效率的影响。结果：当固定茎环引物的茎部结构为14对碱基，规律性改变环部碱基个数分别为15，18，21时，经RT-PCR检测的CT值无差异，均为28.5；当固定茎环引物的环部结构为21个碱基，CT值随茎部碱基对(8，11，14)规律性地延长而逐渐增大；当环部结构为21个碱基，茎部结构为8对碱基时CT值最小，为26.7。结论：环部结构对茎环引物的逆转录效率无贡献；而茎部结构碱基相对越少越有利于提高茎环引物的逆转录效率；当环部结构为21个碱基，茎部结构为8对碱基时，茎环引物的效率和特异性是最佳的，适用于准确检测小家鼠的miRNA-505基因。研究目的：为了验证miR-505基因对小鼠性发育的时间有推迟作用。研究方法：首先构建miR505-3P转基因首建鼠，将首建鼠和B6小鼠进行杂交，然后通过实时荧光定量PCR技术测定F1代miR505-3P的DNA插入拷贝数；因为哺乳动物的性发育是由下丘脑—垂体—性腺轴(HPGA)调控的，所以同时采用逆转录实时荧光定量PCR（RT-QPCR)的方法对下丘脑进行miR-505表达量的检测；最后结合对转基因和野生型小鼠的相关表型，确认miR-505对小鼠的性发育的影响。其中检测的表型有以下4种：生长曲线，阴门开启，传代情况，阴道上皮细胞角质化时间。研究结果：转基因小鼠miR505-3P的DNA拷贝数检测结果：不同F0代的F1代转基因小鼠插入的miR505-3P的DNA拷贝数差别很大，从1-125个拷贝不等；同一个F0转基因亲本的F1代转基因小鼠的miR505-3P的DNA插入拷贝数基本相同；F1代的转基因和野生型小鼠下丘脑中miR505-3P的表达量检测结果：转基因小鼠中，插入miR505-3P拷贝数少的（5个拷贝左右）表达量是野生型的2倍左右，插入miR505-3P拷贝数特别多的表达量却和野生型的小鼠无差异。F1代转基因小鼠与野生型B6的表型对照结果：转基因小鼠阴门开启的时间平均值比野生型小鼠的迟1.65天，但差异并不是特别显著；转基因小鼠的阴道脱落的上皮细胞角质化时间的平均值比野生型小鼠的迟1天左右，但二者差异不明显；统计的生长曲线数据中看出，两种小鼠在相同的时间都稳定的增长，几乎没有差异；从统计的生育情况发现两种小鼠在生育后代的只数和窝数也没有明显的差异。结论：从检测F1代中miR505-3P的DNA拷贝数结果看出外源基因的表达情况和其插入的DNA拷贝数相关，拷贝数太多会导致转基因不表达，只有适量的插入几个拷贝才能有助于基因的表达。从转基因小鼠和B6小鼠的性发育表型结果看出，转基因小鼠的VO时间平均比B6小鼠有推迟的趋势，并且从VO到角质化的时间也有推迟的趋势，这与我们预测miR505-3P调控小鼠性发育延迟的作用相符，但具体是否准确还需进一步证明；通过对比转基因小鼠和B6小鼠的生长曲线和生育情况，说明miR505-3P对小鼠的生长情况和生育情况没有明显的影响。该研究的结果与结论将对本实验室今后进一步探索miR505对哺乳动物性发育的作用奠定了一定的实验和理论基础。