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类胡萝卜素是一类呈黄色、橙红色或红色的多烯类物质,广泛的存在于高等植物、藻类、光合细菌和部分非光合微生物中,具有多种生物学功能。岩藻黄质是类胡萝卜素的一种,占类胡萝卜素总产量的10%以上,具有抗癌、抗炎、抗氧化、减肥、降血脂等多种生物学功能。裙带菜、海带等褐藻中富含大量的岩藻黄质,但是目前关于褐藻中岩藻黄素代谢途径的相关研究还不是很多。本研究采用RT-PCR方法,首次从裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)中克隆得到编码八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的cDNA,命名UpPDS基因,该酶是催化ζ-胡萝卜素形成的关键酶。UpPDS基因的cDNA全长1707 bp,是一个完整的开放阅读框,共编码568个氨基酸。通过与其它物种的PDS氨基酸序列比较,发现八氢番茄红素去饱和酶在进化过程中高度保守,与酸藻PDS、马尾藻PDS等褐藻具有较近的亲缘关系。将UpPDS克隆到表达载体pET-28a上构建pET-28a-UpPDS,将pET-28a-UpPDS和pACPHYTipi(克隆了crtB和crtE)共转化大肠杆菌BL21(DE3)得到了工程菌。利用大肠杆菌的颜色互补实验和高效液相色谱分析(HPLC)方法对UpPDS编码的八氢番茄红素去饱和酶进行生物活性验证,结果表明:工程菌中表达的重组八氢番茄红素去饱和酶能催化底物八氢番茄红素产生ζ-胡萝卜素。在不同的诱导时间、温度、IPTG浓度和起始OD600四种单因素条件下分析大肠杆菌工程菌产生ζ-胡萝卜素产量的情况,然后在单因素的基础上设计正交试验L9(3 4)对大肠杆菌工程菌产生ζ-胡萝卜素产量的条件进行优化。结果显示,在最佳培养条件下,ζ-胡萝卜素的产量可达到5.0 mg/L。构建了植物表达载体pCAMBIA2300-UpPDS,利用侵染法将植物表达载体pCAMBIA2300-UpPDS转入烟草植株中,通过抗性筛选、PCR扩增、Southern blotting等方法鉴定获得转基因烟草植株。利用实时荧光定量PCR方法,以野生型烟草为对照,对转基因烟草中目的基因UpPDS表达情况进行检测,结果显示不同转基因植株目的基因的表达水平不同。使用分光光度法测定叶片中的类胡萝卜素含量,结果表明转基因烟草叶片中的类胡萝卜素含量全部高于野生烟草,转基因烟草类胡萝卜素最高含量较对照组提高了1.29倍。