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基于优质底盘宿主,通过异源表达实现功能蛋白和化学品的高水平、可调控生产,是目前合成生物学和代谢工程领域的研究热点和主要方向之一。由启动子介导的基因转录过程是决定基因表达强度和调控模式的关键步骤,一些来源于不同宿主的高效天然启动子被鉴定开发并广泛应用于学术研究和工业生产。然而,随着生物产业的快速发展,受限于有限的优质启动子数量及单一的信号响应模式,天然转录系统已经难以满足日渐多样化的研究及生产需求。因此,很多研究通过启动子工程和转录因子工程技术,对天然转录系统进行改造,以开发新型调控系统。但是,由于细胞遗传背景和信号调控网络的复杂性限制,天然转录系统的改造一直存在较大的瓶颈,难以同时在表达强度和调控模式上取得突破性进展。随着合成生物学的发展和工程化设计理念的兴起,在优质底盘宿主中通过理性设计和生物元器件的定向组装来开发满足特定需求的人工遗传线路和表达调控开关,为新型转录调控系统和高效表达平台的设计开发提供了新的思路和方法。作为一种真核表达宿主,甲基营养型毕赤酵母因其转录调控系统高效、翻译后修饰能力完善、细胞发酵密度高、培养及纯化简便等诸多优势,在学术研究和工业生产中都有广泛的应用,已经成为成熟、优选的蛋白表达细胞工厂。近年来,对于转录调控机制的解析和基因操作方法的进步大大拓展了毕赤酵母的应用范围,为其工程化设计和人工改造提供了可能。本研究基于合成生物学设计理念,通过功能元件的定向组装,在毕赤酵母中构建了一系列具有特定功能的调控器件,进一步装配得到了一套高效、可控、灵活、可编程的人工转录调控系统,并设计开发了不同调控开关,为重组蛋白的表达提供了强力调控工具和新型表达平台。首先,将原核细胞操纵子来源的蛋白-DNA相互作用元件分别与毕赤酵母内源的转录因子激活域和核心启动子元件进行组合,在毕赤酵母中重构了人工转录遗传线路。对其关键调控元件进行分步优化,得到了一套以LacI-Mit1AD融合激活因子和lacO5-cPAOX1杂合启动子作为核心元件的改进型转录信号增益器件iTSAD,能够实现对输入信号的大幅度放大效果。以毕赤酵母强组成型启动子PGAP作为输入信号时,该器件展现出组成型调控的特征,可以在多种碳源条件下实现高水平表达,最高达到野生型毕赤酵母菌株甲醇强诱导型启动子PAOX1活性的5.2倍,是非常高效的蛋白表达工具。我们进一步对输入、输出信号作用关系进行研究,确定了 iTSAD的调控模型符合米氏方程,即低输入信号强度即可引发高输出信号强度,因而导致过高的渗漏表达水平。因此,iTSAD具备高强度表达能力,但缺乏严谨调控能力,难以实现精细化诱导表达控制。其次,为了降低iTSAD输出信号高渗漏的难题,我们基于CRISPR/dCas9基因调控技术,设计了阻遏调控器件CRISPRiD,通过核心启动子的双位点阻遏设计对转录信号增益器件iTSAD的本底表达进行压制。在cPAOX1内部设计不同的giRNA靶点,对阻遏效果进行评估。在使用靶向TATA框序列的giRNAF1时,可使输出信号强度降低96.0%,有效控制了渗漏水平。但是,进一步对其调控模式探究发现,低剂量的输入信号即可引发CRISPRiD高强度的阻遏效果,导致整套系统的输出信号强度上限受到较大影响。再者,为解决CRISPRiD引发的输出信号强度受限的问题,我们基于反义RNA和核糖开关RNA调控技术,分别设计了 AntiRNA和RiboRNA,通过与giRNAF1相互作用形成二聚体,对CRISPRiD实现了一定的去阻遏效果,可以使输出信号强度分别提升29.5%和7.3%,但是仍旧无法满足严谨调控的需求。在此基础上,进一步设计了基于蛋白调控元件的再激活策略。选取与dCas9功能正交的CRISPR调控蛋白VRER和dCpf1,设计了与之对应的6种激活RNA,并分别评估其对CRISPRiD的去阻遏效果。同时,将调控CRISPR蛋白与其对应的激活RNA组装构建了激活器件CRISPRaD,并评估其对iTSAD的激活效果,实现输出信号强度提升2.2倍,达到野生型强诱导型启动子PAOX1活性的5.6倍。最终,选取兼具去阻遏和激活性能的两组方案VRER+gaRNA2、dCpf1+craRNA3,进行后续人工转录调控系统的设计与装配。最后,基于上述两组方案,我们设计了两套人工转录调控系统,并对其输入、输出信号强度关系进行探究,确定两套系统符合逻辑门“非”门遗传电路的调控特征,且均可以实现高强度、低渗漏表达,可以有效用于基因表达调控。通过对输出信号强度上下限的比较,选取了具有更广调控范围的dCpf1+ craRNA3组合进行新型调控开关的设计和表达平台的开发。在craRNA3介导的人工转录调控系统的基础上,分别装载毕赤酵母内源鼠李糖诱导型启动子PLRA3、甲醇诱导型启动子PDAS1和硫胺素饥饿诱导型启动子P THI11,依次构建了鼠李糖阻遏型调控开关、甲醇阻遏型调控开关和硫胺素诱导型调控开关,均可以实现特定条件下的高强度表达和低渗漏水平。以鼠李糖阻遏型调控开关为例,其呈现鼠李糖浓度响应型调控,且响应较为宽泛的鼠李糖浓度范围并相应产生较宽范围的输出信号强度,表明该调控开关可以通过鼠李糖剂量控制而实现精细表达调控。本研究基于毕赤酵母PAOX1的转录调控机制,通过一系列设计成功开发了毕赤酵母新型人工转录系统和表达平台。该系统具有高强度、灵活可控、可编程的优质性能,为毕赤酵母基因表达提供了新的调控策略,为毕赤酵母细胞工厂的拓展应用提供了新的平台体系。相关策略和效果也可以为其他真核表达宿主的设计开发提供一定的参考价值。