【摘 要】
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研究背景:卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤,细胞减灭术和基于铂类和紫杉烷的联合化疗一直是卵巢癌的主要治疗方式。然而,由于多药耐药性使肿瘤化疗疗效常常受到限制。化疗耐药是影响卵巢癌患者预后的关键因素,尤其是铂类耐药性。其中,顺铂（DDP）耐药仍然是改善卵巢癌患者临床结果的关键挑战。因此,迫切需要可用于早期预测卵巢肿瘤化疗耐药特性的新的生物标志物和逆转耐药性的治疗策略。Hedgehog（Hh）信号通路是胚
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研究背景:卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤,细胞减灭术和基于铂类和紫杉烷的联合化疗一直是卵巢癌的主要治疗方式。然而,由于多药耐药性使肿瘤化疗疗效常常受到限制。化疗耐药是影响卵巢癌患者预后的关键因素,尤其是铂类耐药性。其中,顺铂（DDP）耐药仍然是改善卵巢癌患者临床结果的关键挑战。因此,迫切需要可用于早期预测卵巢肿瘤化疗耐药特性的新的生物标志物和逆转耐药性的治疗策略。Hedgehog（Hh）信号通路是胚胎发育和体内平衡的关键调节剂,在多种肿瘤化疗耐药中起着重要作用。经典的多药耐药常与ATP结合盒转运蛋白的表达有关,多药耐药蛋白1编码基因（MDR1,也称为ABCB1）正向调节包括卵巢癌在内的多种不同类型的癌症的化疗耐药性。我们的前期研究发现,Gli2过表达可导致卵巢癌细胞对顺铂耐药,但具体的调控机制仍不十分清楚。因此,本研究旨在探索MDR1作为潜在的Gli2下游靶标以及Gli2/MDR1轴在促进卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用。研究目的:探讨Hedgehog-Gli2信号通路调控卵巢癌顺铂化疗耐药的具体分子机制。研究方法:1、为了产生耐顺铂卵巢癌细胞SKOV3/DDP,我们通过梯度增加顺铂浓度,连续诱导SKOV3细胞六个月,建立顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDP。2、通过Western blot（WB）实验检测具有不同顺铂敏感性的卵巢癌细胞中Gli2、MDR1、γH2AX的蛋白表达水平。3、通过CCK8实验检测SKOV3、SKOV3/DDP、A2780和A2780/DDP细胞的顺铂敏感性;抑制Gli2或MDR1后,耐药细胞对顺铂抗性的改变。4、通过Ed U细胞增殖实验检测SKOV3、SKOV3/DDP、A2780和A2780/DDP细胞增殖能力。5、通过双荧光素酶报告基因实验检测Gli2对MDR1的转录调控关系。6、通过裸鼠皮下移植瘤实验检测Gli2是否同样影响体内卵巢癌细胞中的顺铂抗性。研究结果:1、WB实验结果显示,与亲本细胞株相比,耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP和A2780/DDP中Gli2和MDR1蛋白表达水平显著增高,DNA损伤分子标志物γH2AX表达量下降;且CCK8结果显示,耐药细胞对顺铂的IC50显著增高;同时,Ed U增殖实验显示耐药细胞增殖能力显著增强。2、SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中转染Gli2干扰质粒或用Gli靶向抑制剂GANT61处理细胞下调Gli2,并联合使用顺铂后,MDR1表达水平显著下调,同时DNA损伤增加,下调Gli2可以逆转卵巢癌细胞对顺铂的抗性,并抑制卵巢癌细胞增殖。3、在过表达Gli2的卵巢癌慢病毒稳定细胞系ES-2-LV-Gli2A中加入MDR1竞争性抑制剂维拉帕米,抑制MDR1表达,同时联合顺铂处理ES-2-LV-Gli2A细胞48h后发现,过表达Gli2同时抑制MDR1可逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性,进一步说明Gli2通过调控MDR1促进卵巢癌细胞顺铂耐药。4、双荧光素酶报告基因实验显示,Gli2仅与MDR1启动子区特定片段结合后使荧光素酶活性增强,说明转录因子Gli2可以与MDR1的启动子的特异区域结合,MDR1是Gli2的直接下游靶标,Gli2正向调节MDR1的表达。5、裸鼠皮下移植瘤实验发现,敲低Gli2可以逆转裸鼠皮下移植瘤中卵巢癌细胞对顺铂的抗性,敲低Gli2使肿瘤组织中MDR1及增殖相关蛋白PCNA表达显著下调,γH2AX及凋亡蛋白Bcl2表达显著上调。结论:1、Gli2参与调控卵巢癌细胞顺铂化疗耐药。2、Hedgehog-Gli2信号通路通过直接调控MDR1表达来调节卵巢癌顺铂化疗耐药。
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