【摘 要】
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背景及目的:鼻咽癌是一类多见于中国南方等地的头颈部恶性肿瘤,与遗传因素、环境改变及EB病毒感染等多种因素有关。目前鼻咽癌的治疗方法主要采用以放疗为主的综合治疗,但由于其起病隐匿,具有高度侵袭性和转移性且周围解剖复杂的特点,导致患者预后不佳。因此,深入探索鼻咽癌可能的治疗靶点对改善鼻咽癌患者的治疗效果和预后生存质量有重要意义。miRNA在多种生理及病理过程中起着重要作用,研究证实miR-29b-3p
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背景及目的:鼻咽癌是一类多见于中国南方等地的头颈部恶性肿瘤,与遗传因素、环境改变及EB病毒感染等多种因素有关。目前鼻咽癌的治疗方法主要采用以放疗为主的综合治疗,但由于其起病隐匿,具有高度侵袭性和转移性且周围解剖复杂的特点,导致患者预后不佳。因此,深入探索鼻咽癌可能的治疗靶点对改善鼻咽癌患者的治疗效果和预后生存质量有重要意义。miRNA在多种生理及病理过程中起着重要作用,研究证实miR-29b-3p的功能失调与癌症的发生发展有关,但其在鼻咽癌中的表达和功能尚不清楚。相关研究报道ROBO1在多种癌症中具有重要的调节作用,但ROBO1在鼻咽癌发挥作用的具体机制尚不清楚。基于生物信息学预测ROBO1为miR-29b-3p的靶基因,本研究主要聚焦miR-29b-3p和ROBO1在鼻咽癌中的异常表达及其功能,并进一步探究其对鼻咽癌肿瘤发生发展影响的具体调节机制。方法:（1）利用GEO数据库分析鼻咽癌中差异表达的miRNA。通过RT-q PCR技术检测鼻咽癌中miR-29b-3p的相对表达量。KM-plotter数据库分析miR-29b-3p与头颈部鳞状细胞癌疾病预后的关系。（2）在鼻咽癌细胞中转染miR-29b-3p的mimics和inhibitor,并分别设置对照组。运用RT-q PCR检测miR-29b-3p的表达情况,验证其转染效率。对转染的鼻咽癌细胞,CCK-8细胞增殖实验、细胞克隆形成实验、EDU染色检测鼻咽癌的增殖能力;细胞划痕实验、Transwell实验检测鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力。体内实验:利用过表达miR-29b-3p的稳定鼻咽癌细胞和正常鼻咽癌细胞进行体内实验:裸鼠皮下注射,建立裸鼠皮下成瘤模型,观察裸鼠成瘤的大小及体积变化等;尾静脉注射,观察裸鼠肺部转移情况。（3）通过生物信息学分析miR-29b-3p的潜在的下游靶向基因。利用Target Scan、miRDB和star Base 3个miRNA靶基因预测数据库,预测miR-29b-3p的可能靶基因。通过GEO数据库分析10例鼻咽癌组织和6例正常组织中预测靶基因的差异表达。Target Scan数据库中预测miR-29b-3p与ROBO1相互作用的可能靶点。运用双荧光素酶报告基因实验确定miR-29b-3p和ROBO1基因在鼻咽癌细胞中是否存在生理性相互作用。Western Blot检测分别转染miR-29b-3p的mimics/inhibitor后,ROBO1蛋白的表达变化。利用RT-q PCR技术,检测鼻咽癌组织及细胞系中ROBO1基因mRNA水平的相对表达。Western Blot检测鼻咽癌细胞系ROBO1的蛋白水平。免疫组织化学染色检测ROBO1蛋白在鼻咽癌组织中相对表达量。（4）在过表达miR-29b-3p的稳转鼻咽癌细胞进一步过表达ROBO1,Western Blot检测ROBO1蛋白的表达变化,并通过相关功能试验验证鼻咽癌细胞增殖、侵袭迁移等生物学行为的变化。结果:（1）GEO数据库分析miR-29b-3p在鼻咽癌中相对表达量较低。RT-q PCR验证鼻咽癌组织及细胞系中miR-29b-3p相对低表达。KM-plotter生存分析曲线结果显示高表达miR-29b-3p的HNSC患者有更高的生存率。miR-29b-3p在鼻咽癌中相对低表达,并且与患者的总体生存率有关。（2）过表达miR-29b-3p后,鼻咽癌细胞增殖及侵袭迁移能力减弱;而下调miR-29b-3p后,鼻咽癌细胞增殖及侵袭迁移能力增强。（3）生物信息学预测miR-29b-3p的下游靶基因为ROBO1。GEO数据库预测ROBO1在鼻咽癌中相对高表达。双荧光素酶报告基因实验结果证实miR-29b-3p和ROBO1基因在鼻咽癌细胞中存在生理性相互作用。过表达miR-29b-3p后,鼻咽癌细胞内ROBO1基因的蛋白表达下降,而下调miR-29b-3p后ROBO1基因蛋白表达水平升高。RT-q PCR实验在鼻咽癌组织及细胞中证明了ROBO1 mRNA水平的高表达。Western Blot及IHC结果提示,在鼻咽癌细胞和组织中ROBO1蛋白水平的高表达。（4）在鼻咽癌细胞内过表达miR-29b-3p的同时进一步上调ROBO1基因,结果提示鼻咽癌细胞中ROBO1基因逆转miR-29b-3p对鼻咽癌的抑制作用,从而进一步证明miR-29b-3p通过调控ROBO1基因抑制鼻咽癌的增殖和侵袭迁移。结论:（1）miR-29b-3p在鼻咽癌中低表达。（2）miR-29b-3p通过调控ROBO1抑制鼻咽癌的增殖、侵袭迁移。
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