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喀斯特洞穴是可溶性岩石与水相互作用所形成的地下空间,其内部由于地理位置相对隔离,具有黑暗、潮湿、寡营养等特点,被认为是陆地上的极端生态系统。微生物群落是洞穴演化和生物地球化学循环的主要驱动力,其中固碳和固氮微生物在响应洞穴碳和氮元素循环乃至全球气候变化等方面发挥着积极作用。为阐明洞穴环境中固碳、固氮细菌群落结构组成,进一步挖掘洞穴环境中微生物资源,本研究从贵州省荔波县采集六个喀斯特洞穴沉积物样品,采用无碳和无氮培养基分别分离固碳细菌和固氮细菌,揭示洞穴环境中可培养固碳细菌和固氮细菌的群落多样性。同时,利用多相分类学对分离潜在新种细菌进行鉴定。1.采用无碳培养基分离洞穴沉积物中固碳细菌,共获得230株细菌,隶属于3门16属64种。分别为变形菌门（Proteobacteria;76.00%）、拟杆菌门（Bacteroidetes;16.00%）、放线菌门（Actinobacteria;8.00%）。其中,变形菌门为优势菌群。优势属为假单胞菌属（Pseudomonas;47.39%）和不动杆菌属（Acinetobacter;20.00%）。固碳细菌Shannon-Wiener多样性指数为3.65,Margalef丰富度指数为11.58,Pielou均匀度指数0.88。不同洞穴沉积物中固碳细菌多样性不同。培养基CFMD较有利于分离洞穴环境固碳细菌,Shannon-Wiener多样性指数和Margalef丰富度指数最高,分别为3.05和6.68。2.采用无氮培养基分离洞穴沉积物固氮细菌,共获得425株细菌,分布于3门13属68种。隶属于变形菌门（98.82%）、放线菌门（0.71%）、拟杆菌门（0.47%）,其中优势门为变形菌门。优势属为假单胞菌属（72.47%）和不动杆菌属（15.52%）。固氮细菌Shannon-Wiener多样性指数为3.43,Margalef丰富度指数为11.07,Pielou均匀度指数为0.81。不同洞穴沉积物固氮细菌多样性不同。利用培养基Nfb分离固氮细菌,Shannon-Wiener多样性指数、Margalef丰富度指数和Pielou均匀度指数较高,分别为3.13、6.95和0.90。3.三株潜在新种细菌（CJ23、LS44、LS1212）的多相分类学鉴定通过对菌株CJ23的菌落形态进行观察,菌株CJ23为乳白色、不透明、圆形、边缘整齐、光滑的菌落。基于16S r RNA基因序列构建的系统发育树发现菌株与节杆菌属A.methylotrophus TGAT和A.cavernae PO-11T聚为一支,相似度分别为98.19%和97.28%。其DNA的G+C含量为66.19 mol%,与其参考菌株的ANI值分别为79.34%和91.00%（种间阈值ANI为95%-96%）,DNA的杂交值别为22.9%和43.1%（新种DNA杂交值阈值为70%）。温度生长范围为4-30℃,最适温度为25℃。Na Cl浓度耐受范围是0-6.5%。柠檬酸盐利用、Voges-Proskauer试验、甲基红试验实验结果为阳性,吲哚产生、H2S产生、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、过氧化氢酶、氧化酶、吐温20、吐温80实验结果为阴性。主要脂肪酸组成为anteiso-C15:0（72.45%）和anteiso-C17:0（15.13%）。极性脂包括糖脂（GL）、双磷脂酰甘油（DPG）、磷酸类脂（PL）和未知极性脂（UL）。主要呼吸醌型为MK-9（H2）。菌株LS44的的菌落形态为白色、圆形、半透明、表面光滑的菌落。基于16S r RNA基因序列构建的系统发育树发现菌株与假单胞菌属P.hydrolytica DSWY01T、P.xionganensis R-22–3 w-18T、P.yangonensis MY50T聚为一支,相似度分别为96.33%、96.93%、96.13%。其DNA的G+C含量为62.44 mol%,与其参考菌株的ANI值分别为78.36%、78.23%、78.40%,DNA的杂交值分别为22.3%、21.7%、22.0%。在4-30℃均能生长,最适温度为25℃。生长的Na Cl浓度范围为0-2.5%,p H耐受范围为6-10。H2S产生、吲哚产生、脲酶、淀粉水解、柠檬酸盐利用、甲基红试验、Voges-Proskauer试验、过氧化氢酶、氧化酶、吐温20、吐温80实验结果为阴性,硝酸盐还原为阳性。主要脂肪酸组分为C16:0（33.06%）、Summed Feature 3(C16:1ω7c/C16:1ω6c;35.09%)和Summed Feature 8(C18:1ω7c/C18:1ω6c;11.95%)。极性脂包括糖脂（GL）、双磷脂酰甘油（DPG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷酸类脂（PL）。主要呼吸醌型为Q6。菌株LS1212的的菌落形态为白色、圆形、不透明、表面光滑的菌落。基于16S r RNA基因序列构建的系统发育树发现菌株与假单胞菌属P.capsici Pc19-1T和P.bohemica IA19T聚为一支,相似度分别为97.56%和97.16%。其DNA的G+C含量为60.23 mol%,与其参考菌株的ANI值分别为78.71%和78.25%,DNA的杂交值分别为23.2%和23.3%。在4-30℃均能生长,最适温度为25℃。Na Cl浓度耐受范围是0-3%,p H耐受范围为6-9。硝酸盐还原、明胶水解、脲酶、淀粉水解、H2S产生、柠檬酸盐利用、吲哚产生、Voges-Proskauer试验、氧化酶、吐温20、吐温80实验结果均为阴性,甲基红试验、过氧化氢酶实验结果为阳性。主要脂肪酸组成为C16:0（27.71%）、Summed Feature 3(C16:1ω7c/C16:1ω6c;36.91%)、Summed Feature 8(C18:1ω7c/C18:1ω6c;17.82%)。极性脂组分含有磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、双磷脂酰甘油（DPG）、未知极性脂（UL）。主要呼吸醌型为Q6。综上,菌株CJ23为节杆菌属（Arthrobacter）的1个新种,命名为Arthrobacter libonensis sp.nov.;菌株LS44和LS1212为假单胞菌属的2个新种,分别命名为Pseudomonas libonensis sp.nov.和Pseudomonas sedimenti sp.nov.。4.将3株新种细菌基因组的RAST注释结果分别进行功能聚类分析发现,3株细菌均有固碳途径关键酶相关基因和氮代谢相关基因,含有次生代谢产物相关基因簇。利用乙炔还原法测定菌株LS44和LS1212的固氮酶活性,分别为36.35 nmol/m L/h和62.68 nmol/m L/h。