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甲状腺癌是近年来在全球范围内发病率持续上升,发病年龄日益年轻化的内分泌相关恶性肿瘤,其中甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid cancer,PTC)占所有甲状腺癌类型的80%以上。PTC的男女发病比例约为1:3,女性青春期后发病率急速上升,绝经后又迅速回落。PTC这一流行病学上的适龄女性偏好与内源性雌激素分泌水平的变化一致,凸显了雌激素信号通路对其发生发展的重要影响。雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)不仅是人体发育第二性征的调控枢纽,同时也是人体内分泌相关恶性肿瘤发生与进展的重要调节因子。共激活因子不仅是ERα活性的重要调节机制,同时也是靶向ERα通路的重要干预策略。内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemical,EDC)是一类可对内分泌系统造成不良影响的化学污染物。部分EDC具有雌激素样效力,可与ERα结合,因此被视为PTC的潜在致病因素。氨基苯酚是精细化工中间体,主要用于药物、染料及显影剂的制造,氨基苯酚因其可抑制胰岛素释放而被列为EDC。为了阐明ERα与PTC的关系以及进一步明确PTC发生发展中的分子机制,本文将从以下两个部分进行阐述:第一部分氨基苯酚对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响及其机制研究背景及目的:雌激素可与细胞核内的受体(主要为ERα与ERβ)结合,以雌激素反应元件(Estrogen response element,ERE)依赖或不依赖的形式调控靶基因的表达;雌激素还可与细胞膜上的受体(主要为GPR30)结合,导致激酶活化,从而快速激活相关信号通路。氨基苯酚是内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemical,EDC)的一种,具有雌激素样效力,可与ERα结合,可上调人甲状腺乳头状癌细胞BHP10-3中ERα/ERβ及GPR30的表达水平,并快速激活PI3K-m TOR信号通路,起到促增殖作用。但是,目前EDC与甲状腺癌相关研究仍处于起步阶段,尚无流行病学与临床证据的数据支持,仅有少量细胞与动物实验结果。本研究的目的是从基因、蛋白、细胞及动物层面探索EDC对人甲状腺乳头状癌发生发展的影响,探索避免EDC暴露对预防甲状腺癌的意义,并且为甲状腺癌的治疗靶点探索新的路径。方法:本研究在基因层面,通过荧光素酶报告基因与染色质免疫共沉淀技术分别分析了氨基苯酚与ERα结合ERE能力与ERα在CTSD基因(ERα靶基因,编码组织蛋白酶D)启动子区募集的影响;在蛋白质层面,通过SDS-PAGE与Western blot检测了氨基苯酚对Cyclin D1表达水平的影响;在细胞与动物层面,通过构建皮下异位移植瘤小鼠表明了氨基苯酚对人PTC细胞BHP10-3体内增殖的影响。结果:本研究探索氨基苯酚可在人PTC细胞BHP10-3中剂量依赖地提高ERα的转录因子活性:诱导ERα结合ERE,增加ERα在CTSD基因启动子区的募集,上调Cyclin D1的表达水平,最终促进BHP10-3细胞的体内增殖。氨基苯酚的激素样效力可被ERα的阻断或敲低显著抑制。结论:本研究结果初步扩展了对EDC在PTC发生发展中作用的理解,探索了氨基苯酚在PTC发生发展中的作用与机制,提示了避免氨基苯酚暴露的必要性,并表明了ERα可能是PTC临床治疗的潜在靶点。第二部分mi R-3652/PES1通路调控甲状腺乳头状癌细胞增殖的机制研究背景及目的:PES1是一种包含乳腺癌相关基因(Breast cancer–associated gene 1,BRCA1)羧基端结构域(BRCA1 C-terminal domain,BRCT),具有转录因子活性的核仁蛋白。微小RNA(micro RNA,mi Rs)是一类重要的非编码RNA,由RNA聚合酶II(RNA polymerase II,RNA Pol II)负责转录,能够通过序列特异性的方式识别目标基因m RNA的3’末端非翻译区(3’UTR,3’Un-translation regions)中的mi RNA的结合位点。mi Rs与m RNA相互识别后,能够诱导Dicer将mi Rs目的基因m RNA降解,此过程便是转录后基因表达沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)。利用生物信息学工具进行分析,能够预测出潜在作用于特定基因的mi RNA。将mi R克隆至相应表达载体再包装为病毒颗粒,转染恶性肿瘤细胞能够通过抑制原癌基因、癌基因发挥抗肿瘤作用。该研究基于ERα的重要共激活因子PES1的功能与作用机制,旨在揭示mi R-3652/PES1在甲状腺乳头状癌细胞中调控ERα的作用及对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响。方法:使用荧光素酶报告基因检测技术检测PES1对ERα转录因子活性的影响;使用定量PCR、蛋白免疫印迹实验检测ERα、PES1以及ERα下游基因Cyclin D1在细胞及组织中的表达;使用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)技术确定PES1与ERα的相互作用;使用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)检测ERα在其下游基因启动子区的募集作用;收集甲状腺来源组织标本,从标本中分离得到患者来源的肿瘤细胞(Patient-derived cells,PDCs)并培养现有甲状腺乳头状癌细胞系BHP10-3;利用在线生物信息学工具mi RDB(mi RNA data base)预测作用于PES1的mi RNA:mi R-3652;使用真核细胞转染实验、蛋白免疫印迹实验以及荧光素酶报告基因系统对mi R-3652作用于PES1的靶标确证研究;使用荧光素酶报告基因系统、定量PCR、蛋白免疫印迹、染色质免疫共沉淀等技术检测mi R-3652对ERα信号通路的影响,同时构建PES1的突变体确定mi R-3652作用的特异性;使用细胞集落形成(平板克隆实验)、Transwell实验以及裸鼠成瘤实验等确定mi R-3652对甲状腺乳头状癌细胞体外增殖、体内增殖作用的影响;使用SPSS软件进行统计学等相关性分析。结果:(1)PES1能够与ERα相互作用、上调ERα的转录因子活性并促进ERα在其下游基因启动子区的募集作用;(2)在BHP10-3细胞中过表达PES1能够促进细胞的增殖作用、促进细胞的体外转移与侵袭作用;(3)mi R-3652能够通过作用于PES1的3’UTR区域,抑制甲状腺乳头状癌细胞BHP10-3的增殖作用;(4)在甲状腺来源组织中,PES1的表达水平与ERα下游基因Cyclin D1的表达正相关;mi R-3652的表达水平与PES1的表达负相关、与ERα下游基因Cyclin D1的表达负相关。结论:本研究立足于ERα这一甲状腺癌新的干预靶标与调控枢纽,着眼于PES1这一ERα的重要转录激活因子与ERα在甲状腺乳头状癌细胞中的相互作用,筛选得到mi R-3652这一潜在作用于PES1的mi RNA分子并进行了靶标确证研究,不仅在临床标本中明确了相关分子表达的临床意义,并利用多个层面上的研究技术(包括生化与分子生物学技术、细胞生物学技术、动物实验)进行相关研究,最终确定PES1与ERα在甲状腺乳头状癌细胞中的相互作用:PES1能够在甲状腺乳头状癌细胞中上调ERα的转录因子活性、促进ERα在其下游基因启动子区的募集作用;并发现mi R-3652是潜在作用于PES1的微小RNA分子(micro RNA),明确了其在甲状腺乳头状癌细胞中的作用:mi R-3652能够通过作用于PES1在甲状腺乳头状癌细胞中下调ERα通路的活性,抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖作用,最终发挥抗肿瘤活性。