职业接触三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)诱发的过敏性皮炎是我国近年来倍受关注的一类新发职业病，由于其危害严重，死亡率高，成为我国职业卫生工作面临的一个急待解决的新课题。该病以严重的全身性皮肤损害为主要特征，同时伴有发热、浅表淋巴结肿大、粘膜红肿糜烂以及肝功能损伤，病情严重者可因并发肝、肾功能衰竭而死亡。由于该病发病机制不清，到目前为止尚无特异性预防和治疗手段，临床上只能在病症发作时对症治疗，或者使发生过敏症的个体脱离接触，但新的劳动者的不断加入增加了群体该类疾病的危险性。此外，由于工艺上的原因，近期内还不可能完全替代或禁止TCE的使用，并且这类企业工人的流动性很大，每年都有大量新工人暴露于TCE，近年来其发病率仍呈上升势头。因此研究TCE过敏性皮炎的发病机制，寻找有助于早期检出易感个体的标志物，对于降低该病的发病率，保护易感人群具有非常重要的意义。 从TCE的接触到过敏反应的发生，包括两个基本的生物学事件，即TCE代谢活化形成半抗原和免疫系统对侵入的半抗原的免疫应答。这两个事件在所有TCE接触个体中都会存在，然而事实表明，在相同的作业环境下，仅有小部分人发生TCE过敏性皮炎，提示不同个体对TCE过敏性皮炎的易感性存在差异。 在正常状态下，机体对入侵物的免疫应答，通过免疫细胞的活化清除异物，并通过分泌的细胞因子对免疫反应进行调节，使机体不至于出现过强的免疫应答反应。据此推测发生TCE过敏性皮炎的个体，可能存在TCE代谢异常，导致形成的半抗原在量上超出了机体正常免疫应答的范围而致病；也可能免疫细胞过度活化或细胞因子的免疫调节功能异常，导致机体免疫系统的平衡状态被打破，出现免疫学紊乱。为验证上述假说，本研究通过人群的分子流行病学研究和动物实验研究，从TCE的代谢和机体的免疫应答两个角度，探讨TCE过敏性皮炎的发病机制，寻找可用于预防的易感性生物标志物。 一.三氯乙烯过敏性皮炎的遗传易感性研究本研究采用病例-对照设计，对111名TCE过敏性皮炎病人和154名TCE接触对照工人的TCE代谢酶基因和免疫相关细胞因子的基因多态性与TCE过敏性皮炎易感性的关系进行了研究。结果如下：1.TCE代谢酶中，结合通路重要的解毒酶NAT2基因多态性与TCE过敏性皮炎易感性之间具有显著性关联。病例组中NAT2*4等位基因和NAT2快代谢型的分布频率明显低于对照组，具有NAT2慢代谢型的个体患TCE过敏性皮炎的相对危险度是快代谢型个体的2.01倍(95％CI=1.10-3.65)。推测其作用机制可能是由于β-裂合酶与NAT2竞争催化TCE的中间代谢产物二氯乙烯基半胱氨酸的代谢，NAT2慢代谢型的个体，经β-裂合酶代谢通路的通量增加，产生的巯基烯酮类活性中间代谢产物作为免疫原性物质引发了机体异常的免疫应答反应，导致TCE过敏性皮炎的发生。虽然NAT1基因型及代谢表型在两组间分布频率无显著性差异，然而同时具有NAT1和NAT2慢代谢型的个体与二者同为快代谢型的个体比较，患病的相对危险度进一步增加(OR=2.71，95％CI=1.29-5.70)，相对危险度水平高于单独携带NAT2慢代谢型的个体，提示NAT1与NAT2基因多态性在影响个体TCE过敏性皮炎患病危险度方面存在联合作用。 2.免疫相关的细胞因子基因多态性研究发现，TNF-α-308位点变异型等位基因(Ⅱ型等位基因)在病例组的分布频率低于对照组，携带变异基因型的个体患TCE过敏性皮炎的相对危险度明显低于野生型个体(OR=0.398，95％CI=0.164-0.967)。TNF-α在过敏性皮炎发生过程中起着十分重要的作用，它能够刺激皮肤组织的细胞合成趋化性细胞因子，诱导炎症反应细胞进入抗原侵入部位，从而引发并扩大炎症反应。本研究结果提示TNF-αG-308A基因多态性是TCE过敏性皮炎发生的危险因素之一。 3.未发现其它的TCE代谢酶CYP1A1、CYP2E1、GSTT1、GSTP1、GSTM1及免疫相关的细胞因子TNF-αG-238A位点、IL-4C-590T位点、IL-10A-592C位点及TNF-β基因多态性与TCE过敏性皮炎易感性之间的关联。 二.三氯乙烯过敏性皮炎发病机制的动物实验研究(一)豚鼠模型利用TCE染毒的豚鼠模型来研究TCE对皮肤、肝、脾的病理组织学损害、对固有免疫系统中NK细胞活性的影响、特异性免疫系统中淋巴细胞的活化、以及抗体的产生及其作用，以期对TCE的免疫毒性及其诱发的接触性过敏反应有一个整体的认识。结果如下：1.以TCE对豚鼠皮内注射和涂皮致敏处理2周后，以20％TCE激发，豚鼠皮肤出现红斑水肿反应，阳性率为67％。皮肤的病理组织学检查发现炎症部位有大量的嗜酸性粒细胞浸润。对TCE过敏性皮炎病例虽未做皮肤的病理组织学检查，但发现血液中嗜酸性粒细胞数量显著升高，已往研究表明组织中嗜酸性粒细胞浸润与活化往往与外周血中嗜酸性粒细胞数量增多相关联。人体中嗜酸性粒细胞主要分布于呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜组织中，可能与TCE过敏性皮炎病人出现的眼、口、生殖器等处的粘膜损伤有关。 2.TCE致敏豚鼠脾淋巴细胞与TCE共培养后，出现抗原特异性增殖反应，证实TCE对豚鼠皮肤的病理组织学损害为接触性过敏反应，排除了TCE原发性刺激的可能性。豚鼠脾淋巴细胞对TCE的代谢能力较弱，需加入体外活化系统S9混合液协助其对TCE的代谢。TCE本身具有细胞毒性，不具有半抗原活性，而其代谢产物可作为半抗原诱发脾淋巴细胞的抗原特异性增殖。 3.TCE致敏组豚鼠血清IgG含量与溶剂对照组比较明显升高(5.51±1.63和3.13±1.24mg/ml，P＜0.05)，提示体液免疫参与了TCE过敏性皮炎的发生过程。 4.淋巴细胞及NK细胞是生物体内重要的免疫活性细胞，在机体特异性免疫和非特异性免疫中发挥重要作用，接触化学物后淋巴细胞及NK细胞功能的变化是评价该化学物免疫毒性的两个重要指标。研究结果表明，在本实验染毒方式和染毒剂量下，未见TCE对体内T淋巴细胞的增殖功能和NK细胞杀伤功能的影响。 (二)小鼠模型模拟现场工人的接触条件，以皮肤接触和吸入两种方式同时对小鼠染毒，从TCE的代谢和机体免疫(体液免疫、细胞免疫、相关的细胞因子)两个角度探索TCE诱发过敏性皮炎的发病机制。 1.通过TCE吸入及皮肤接触两种方式同时对小鼠染毒处理，脾淋巴细胞与TCE体外共培养后发生抗原特异性增殖，提示小鼠被致敏。 2.在致敏阶段，CD4+T细胞与CD8+T细胞均发生增殖活化，通过分泌的细胞因子发挥免疫诱导和免疫调节作用。TCE致敏组小鼠IFN-γ/IL-4比值明显低于溶剂对照组(0.54±0.12和0.90±0.22，P＜0.01)，IFN-γ/IL-4反映了效应性T细胞/调节性T细胞发挥作用的一种平衡状态，TCE致敏小鼠体内调节性T细胞能够通过分泌的IL-4抑制过敏反应的发生。 3.TCE致敏小鼠脾淋巴细胞中抗原特异性B细胞发生活化，在体外细胞培养实验中经半抗原的刺激分泌IgG抗体；但体内检测发现血清中IgG含量在致敏组与溶剂对照组之间无显著性差异。对小鼠模型和豚鼠模型中IgG和炎症反应的关系进行比较，发现小鼠模型未出现耳肿胀反应，血清中IgG含量也未发生明显变化；而在豚鼠模型中出现了皮炎症状，血清中IgG含量也明显升高；这些结果提示IgG与TCE诱发的过敏性皮炎具有一定的相关性。 4.TCE在体内具有多种代谢产物，本研究以乙醇和苯巴比妥对小鼠CYP450进行体内诱导，并在脾淋巴细胞体外培养过程中分别以AOAA和SKF对β-裂合酶和CYP450进行抑制，研究TCE不同代谢产物在致过敏和肝毒性中的作用。结果显示，在谷胱甘肽介导的结合代谢通路中，β-裂合酶催化生成的巯基烯酮类物质是诱发小鼠过敏反应的特异性半抗原，与人群研究中发现的结合通路中解毒酶NAT2慢代谢型个体(β-裂合酶增毒代谢通路竞争性增强)发病危险性增高相一致。而TCE氧化通路的代谢产物是产生细胞毒性和肝损伤的主要物质，乙醇和苯巴比妥通过诱导CYP450酶的活性而增加TCE氧化通路的代谢通量，从而增加TCE的肝脏毒性。结合人群中TCE过敏性皮炎病例的临床表现，本研究结果从代谢的角度阐明了TCE诱发过敏性皮炎并伴发肝损伤的原因。 总之，本研究通过人群的分子流行病学研究发现了TCE致过敏性皮炎的易感性生物标志物，而且在动物实验中得到了佐证，TCE结合通路代谢产物在TCE过敏性皮炎发生过程中起到重要作用。动物实验的研究结果也阐释了人群TCE过敏性皮炎伴发肝损伤及粘膜损伤等一系列临床表现，揭示了TCE过敏性皮炎是由体液免疫和细胞免疫共同参与、多种细胞因子相互作用的复杂的免疫学反应过程。研究还发现IL-4对于调节过敏反应进程，防止过强的免疫应答发挥一定的作用，为今后临床上开展TCE过敏性皮炎的针对性免疫治疗提供理论依据。此外，由于对职业性过敏性疾病的发病机制和预防控制的研究较少，因此本研究对TCE过敏性皮炎防治工作的开展具有重要指导意义和参考价值。