课题背景：原发性骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是常见的老年退变性疾病，近年来数量不断增加，已成为导致中老年人残障的第二大病因，但其发病机制尚不清楚。最近研究表明：干细胞的老化是组织、器官老化的重要内在因素。2004年Dowthwaite GP等发现人关节软骨内存在间充质祖细胞(Mesenchymal Progenitor Cells, MPCs)。而Alsalameh等发现正常人关节软骨内间充质祖细胞数量较原发性骨关节炎关节软骨内间充质祖细胞多。本实验室前期研究也表明：原发性骨关节炎单位体积内OA关节软骨MPCs细胞数量明显少于正常组，同时其增殖及向软骨分化能力也明显较正常组低下。鉴于关节软骨MPCs在软骨损伤修复中的重要作用，因此其老化在OA关节软骨退变中发挥了重要作用，但目前关节软骨MPCs老化的机制并不清楚。新近发现：Wnt信号激活可能与干细胞老化密切相关。近期研究证实，OA关节软骨内存在Wnt蛋白表达。在发生机械性损伤的人关节软骨内，Wnt信号靶基因Axin-2和c-JUN表达上调，分泌型卷曲蛋白(sFRP，Wnt信号的拮抗分子，竞争性结合Wnt蛋白)表达下调，提示Wnt信号激活。近期研究还发现：Wnt信号通路与p53/p21通路相关。Wnt信号通路的靶基因TCF4同样是p53的靶基因。在人视网膜母细胞瘤细胞胞浆内β-catenin过表达可以增加p53的转录活性。在近期的文献中，观察到ORS(Old rat serum,老年小鼠血清)组比YRS(Young rat serum,年轻小鼠血清)组的p53和p21明显增多，在100ng/mLDKK1和si-β-catenin处理后，p53和p21的表达大幅度下降。这个结果提示Wnt通路与p53/P21发现通路存在交联。鉴于p53/p21通路作为细胞老化的重要通路，由此推测：激活的Wnt信号可能通过p53/p21通路诱导MPCs增殖及分化能力下降，促进OA的发生发展。目的本研究拟通过检测正常人MPCs和OA患者MPCs中Wnt3a的表达，并观察Wnt3a/beta-catenin信号激活和阻断对正常人MPCs增殖及向成软骨分化的影响，探讨Wnt信号对MPCs老化的影响；通过构建p53荧光报告质粒，观察Wnt信号激活对MPCs中p53表达的影响，同时利用构建p53的siRNA病毒抑制p53表达，研究其对Wnt信号激活引起的MPCs老化的阻断，阐明p53/p21通路在Wnt信号激活促MPCs老化中的介导作用，以探讨Wnt信号对MPCs老化调控的机制，为后期深入研究OA的病理机制提供初步的基础。方法：1.Wnt信号激活对MPCs老化的作用研究1.1关节软骨标本及MPCs获取1.1.1标本来源：选取2009-2011年本科因OA行全膝关节置换术的患者需移除的软骨(OA组)，取材部位为股骨后髁，包括男性8例，女性16例，平均年龄(52.5±3.0)岁。选取同期本科30例因股骨颈骨折行全髋关节置换术的患者需移除的股骨头软骨(对照组)，包括男性11例，女性19例，平均年龄(58±5.2)岁。所有患者术前均已签署知情同意书。按Outbridge分级标准选取大体观察无异常及纤维化病变的关节软骨。1.1.2关节软骨MPCs获取1.1.2.1关节软骨细胞酶消化和分离切取正常关节软骨制备成1mm3左右的碎块，系列酶消化、分离关节软骨内细胞，制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞。1.1.2.2关节软骨MPCs定量分析样品管和对照管分别加入100μl细胞悬液(含1×106个细胞)，样品管加荧光标记单克隆抗体CD105、CD166(1：100稀释)，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30分钟。加入PBS＋1%FBS＋0.1%NaN31ml，500g离心5分钟，小心吸去上清液终止反应。加入PBS＋1%FBS＋0.1%NaN31ml，500g离心5分钟。洗涤细胞，小心吸去上清液，加入PBS400μlr摇匀，流式细胞仪检测。统计分析，比较MPCs的量。1.1.2.3关节软骨MPCs免疫磁珠分选采用我们前期改良的免疫磁珠分选方法。将鼠抗人CD105单克隆抗体与抗鼠的磁结合二抗在4℃孵育20分钟，抗原抗体复合物冲洗3次后重悬于1ml培养液，加入酶消化分离关节软骨的细胞，总颗粒细胞比为50：1，细胞-颗粒复合物轻轻振荡，4℃孵育20分钟，免疫磁珠分选10分钟后，细胞-磁珠复合物重悬在木瓜凝乳蛋白酶溶液中，4℃孵育10-20分钟以破坏抗原抗体反应，获得CD105阳性细胞，在37℃、5%CO2孵箱内培养3-5天；采用类似方法，再用鼠抗人CD166单克隆抗体结合的免疫磁珠分选CD105阳性细胞，获得的CD105/CD166阳性细胞在37℃，5%CO2孵箱内培养，部分细胞用流式细胞仪检测CD105/CD166阳性细胞比例。1.2Wnt信号在正常人和原发性骨关节炎患者关节软骨及MPCs的表达1.2.1标本来源：方法同前。1.2.2标本取材：方法同前。1.2.3Wnt信号在关节软骨MPCs的表达1.2.3.1关节软骨的Wnt1，Wnt3a，Wnt5a，β-catenin免疫组化分别取正常软骨及原发性OA关节软骨，0.05%protease XIV预处理后，10%甲醛固定，脱水石蜡包埋切片后行Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、β-catenin染色免疫组化。1.2.3.2正常软骨及原发性OA关节软骨MPCs中Wnt1，Wnt3a，Wnt5a，β-catenin表达1.2.3.2.1Real-time PCR分别检测正常软骨及原发性OA关节软骨MPCs中Wnt1，Wnt3a，Wnt5a，β-catenin的表达量。MPCs获取同前。1.2.3.2.2Western blotting法检测正常软骨及原发性OA关节软骨MPCs中β-catenin表达MPCs细胞种入24孔板，加入终浓度为30mmol/L的LiCl，过夜后收集细胞裂解液,，离心后的上清在Laemmli样品缓冲液中煮沸变性，电泳分离后转膜，一抗即抗β-连环蛋白的抗体，二抗为含辣根过氧化物酶的抗鼠IgG抗体，β-actin参照。1.2.4Wnt信号激活对MPCs增殖、向软骨细胞分化的影响1.2.4.1Wnt信号激活条件培养基的配制：分别配制两种Wnt3a的条件培养基。Wnt3a条件培养基用纯化的Wnt3a(R&D systems)配制(浓度为100ng/ml)，培养均在包被了1/10ECM胶的8孔板上进行。1.2.4.2Wnt信号激活对细胞增殖的影响将MPCs细胞分成四组：MPCs+普通培养基组、MPCs+Wnt3a条件培养基组、MPCs+普通培养基+Wnt信号阻断条件培养基组、MPCs+Wnt3a条件培养基+Wnt信号阻断条件培养基组。然后，分别取各组细胞配成2.0×104cells/ml细胞悬液，每孔铺100μl，铺两块96孔板。1.2.4.3Wnt信号激活对MPCs向软骨细胞分化的影响在Wnt3a条件培养基中加入软骨细胞分化诱导剂(1mmol/L丙酮酸钠、1×10-7mol/L地塞米松、1%ITS、10ng/ml rhTGF-β3和抗生素)，培养1周后，用Real-time PCR检测MPCsⅡ型胶原、aggrecan、SOX9的mRNA量表达。普通软骨细胞分化诱导培养基作为对照。1.2.5阻断Wnt信号激活对MPCs增殖、向软骨细胞分化的影响1.2.5.1Wnt信号阻断条件培养基的配制：普通培养基和Wnt3a条件培养基中分别加入sFRP3(100ng/ml)、DKK-1(100ng/ml)。MPCs分别在上述培养基中培养，普通培养基对照。1.2.5.2Wnt信号阻断对细胞增殖、向软骨细胞分化的影响MPCs在普通和Wnt信号阻断条件培养基培养，细胞增殖、向软骨细胞分化方法同上。1.2.6Wnt信号同时激活和阻断对MPCs增殖、向软骨细胞分化的影响1.2.6.1Wnt信号激活条件培养基的配制：配制两种分别含Wnt3a的条件培养基。Wnt3a条件培养基用纯化的Wnt3a (R&D systems)配制(浓度100ng/ml)，培养均在包被了1/10ECM胶的8孔板上进行。1.2.6.2Wnt信号阻断条件培养基的配制：普通培养基和Wnt3a条件培养基中分别加入sFRP3(100ng/ml)、DKK-1(100ng/ml)。MPCs分别在上述培养基中培养，普通培养基对照。1.2.6.3Wnt信号激活同时激活和阻断对细胞增殖、向软骨细胞分化的影响MPCs在普通和Wnt信号激活、阻断条件培养基培养，细胞增殖、向软骨细胞分化方法同上。2. p53/p21通路在Wnt信号激活促MPCs老化中作用的研究2.1Wnt信号激活对MPCs中p53表达的影响2.1.1p53荧光报告病毒载体的构建及转染MPCspLVX-P53启动子-EGFP-3FLAG是pLVX-EGFP-3FLAG载体的CMV启动子替换为p53启动子得到的(Mlu I和Xho I酶切位点)，用EcoR和Xba I对表达载体进行双酶切，切去EGFP-3FLAG片段，替换为荧光素酶基因。用Mlu和Xho I对表达载体进行双酶切，切去CMV启动子片段，酶切产物电泳后回收约7.1kb的载体片段。p53启动子同源重组入表达载体转化受体菌后阳性克隆鉴定。LUC启动子同源重组入表达载体转化受体菌后阳性克隆鉴定，LUC质粒阳性克隆测序。病毒包装病毒、浓缩、纯化。2.1.2Wnt信号激活及阻断对MPCs中p53表达的影响(mRNA、蛋白及荧光素酶表达)将MPCs分成四组：A：MPCs+普通培养基，B：MPCs+普通培养基+Wnt信号阻断条件培养基，C：MPCs+Wnt3a，D：MPCs+Wnt3a条件培养基+Wnt信号阻断条件培养基。P53引物序列信息如下：F:CCCAAGCAATGGATGATTTGAR:GGCATTCTGGGAGCTTCATCT培养1周后，RT-PCR检测MPCs中II型胶原、aggrecan及SOX9的mRNA表达量。将测得的D(570)值绘制成生长曲线。在普通及Wnt3a条件培养基中培养转染p53/LUC质粒的MPCs。采用荧光检测仪检测两种培养条件MPCs的荧光强度，比较p53的表达。2.2Wnt信号激活对转染p53干扰慢病毒的MPCs增殖、分化的影响以转染p53干扰慢病毒的MPCs为培养细胞，Wnt信号激活条件培养基的配置同前。细胞增殖、向软骨分化同前述方法。普通培养基作为对照。结果：1.正常关节软骨MPCs中Wnt1和Wnt3a的mRNA表达较OA患者MPCs中的低，且差异显著；正常MPCs中的β-catenin mRNA表达较OA患者MPCs中的β-cateninmRNA没有明显差异，正常MPCs中的β-catenin蛋白水平较OA患者MPCs中的低，有明显差异。因OA患者MPCs中Wnt1和Wnt3a及β-catenin蛋白表达明显增加，说明其存在Wnt信号激活的情况。2.关节软骨MPCs在Wnt信号激活时增殖能力降低，阻断Wnt信号增殖能力增强，Wnt信号激活的同时加试剂阻断，其增殖能力有所恢复； MPCs在激活Wnt信号的情况下成软骨诱导后CollagenII、aggrecan、SOX9的mRNA表达量与正常MPCs成软骨诱导时均大幅减低，有明显差异；MPCs在阻断Wnt信号的情况下成软骨诱导后CollagenII、aggrecan、SOX9的mRNA表达量与MPCs成软骨诱导时均没有差异；Wnt信号激活的同时加试剂阻断，其表达有所恢复，差异明显。MPCs中的Wnt信号激活后β-catenin蛋白较未激活的MPCs大幅增多；MPCs中的Wnt信号阻断后β-catenin蛋白较MPC常规培养组少；Wnt信号激活的同时加试剂阻断时β-catenin蛋白恢复到正常人MPCs水平。3.关节软骨MPCs中的Wnt信号阻断后P53基因及蛋白表达较未激活的MPCs中的少，差异显著；MPCs中的Wnt信号激活后P53基因及蛋白表达较未激活的MPCs大幅增多,差异显著，MPCs中的Wnt信号激活后阻断P53基因水平表达恢复到未激活的MPCs水平，但P53蛋白水平表达较正常人MPCs Wnt信号激活组降低。4.正常关节软骨MPCs中的Wnt信号激活后P53启动子荧光素酶表达水平表达较正常人MPCs大幅增多,差异显著；正常人MPCs中的Wnt信号阻断后P53启动子荧光素酶表达水平表达较正常人MPCs中的少，差异显著；正常人MPCs中的Wnt信号激活后阻断P53启动子荧光素酶表达水平较正常人MPCs Wnt信号激活组降低，但没有差异。5.正常培养基和Wnt3a诱导培养基中的关节软骨MPCs在p53RNAi干扰时增殖明显加快，有明显差异。正常培养基和Wnt3a诱导培养基中的MPCs在p53RNAi干扰时增强成软骨诱导后collagenⅡ、aggrecan及SOX9mRNA的表达。结论：1. OA患者关节软骨MPCs中Wnt1和Wnt3a及β-catenin蛋白表达明显增加，表明其存在Wnt信号激活情况。2. Wnt信号对关节软骨MPCs的增殖存在影响，其激活将使MPCs的增殖能力下降；Wnt信号影响MPCs向软骨分化，其激活将抑制MPCs向软骨分化。这提示激活的Wnt信号将降低关节软骨MPCs对损伤软骨的修复能力。3.在关节软骨MPCs中P53基因及蛋白水平表达和Wnt信号激活相关；Wnt信号激活后关节软骨MPCs中P53表达增加，同时其增殖及向软骨分化能力下降；而阻断p53的表达，Wnt信号激活则对关节软骨MPCs的增殖及向软骨分化无明显影响。这提示，p53/p21通路在Wnt信号激活促MPCs老化中起介导作用。激活的Wnt信号经p53/p21通路促MPCs的增殖及分化能力下降。Wnt信号对关节软骨损伤的修复存在可能的调控作用。