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背景:近年来,随着现代医学的发展及对肿瘤的研究逐渐深入,肿瘤免疫疗法受到广泛关注。特别是以程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1,PD-1)/程序性死亡配体1(programmed cell death ligand protein 1,PD-L1)为代表针对免疫检查点的治疗性抗体,在治疗晚期恶性肿瘤方面取得了重大突破。因此,寻找新的免疫检查点,并研制针对其的治疗性抗体成为一种新的趋势。抑制性免疫检查点淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3)可以抑制T细胞活化和细胞因子分泌,从而确保免疫稳态。它对各种类型的淋巴细胞产生不同的抑制作用,并与PD-1具有协同作用,成为具有巨大的治疗潜力的免疫检测点候选靶点。目前,临床试验正在积极地开展靶向LAG-3的免疫抑制剂疗法,抗LAG-3和抗PD-1的联合免疫疗法在对抗PD-1耐药性方面显示出较好的临床效果。本文中我们成功制备出了靶向免疫检查点LAG-3的新型全人源单克隆抗体,并对其生物活性进行鉴定,为后续研究奠定基础。目的:通过实验室自行构建的大容量全人源噬菌体抗体库筛选得到特异性抗LAG-3的单链(sc Fv)抗体,并利用同源重组技术获得全人源抗LAG-3的完整抗体并鉴定其生物活性。方法:利用本实验室自行构建并优化的全人源噬菌体抗体库,经过多轮的“吸附-洗脱-扩增”过程,筛选全人源抗LAG-3单链噬菌体抗体,采用ELISA实验、DNA序列分析方法初步鉴定后,获得特异性抗LAG-3的全人源单链抗体,采用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)测定抗LAG-3噬菌体源单链抗体的亲和力常数,随后进行噬菌体单链抗体的可溶性表达,再通过PCR技术和同源重组技术及真核表达系统获得全人源抗LAG-3的完整抗体,采用protein A亲和层析的方法分离纯化抗体,进一步采用SDS-PAGE电泳鉴定完整抗体纯度,用ELISA方法鉴定抗LAG-3完整人源抗体与不同来源蛋白的特异性,利用流式细胞术的方法鉴定抗LAG-3完整人源抗体与激活T细胞的结合能力。结果:1.通过3轮筛选富集,经ELISA鉴定及序列分析,获得了29个阳性克隆与人LAG-3重组蛋白结合,其中有16个克隆具有特异性,在16个阳性克隆中有4种基因型,亲和力测定结果按照从高到低排列依次为2号、8号、14号、13号。其中2号单链抗体的亲和力最好,为3.48×10-10。2.成功构建了完整的抗LAG-3全人源单克隆抗体,真核转染经亲和纯化后鉴定,完整抗LAG-3全人源单克隆抗体纯度达到90%以上。3.采用ELISA方法鉴定完整抗LAG-3全人源单克隆抗体的特异性,结果显示LAG-3-2、LAG-3-8、LAG-3-13完整全人源抗体具有特异性,流式细胞术结果表明LAG-3-2、LAG-3-8、LAG-3-13三种完整全人源单克隆抗体都可与激活T细胞结合,其中LAG-3-2完整全人源单克隆抗体结合活性最好。结论:利用大容量全人源噬菌体抗体库,筛选出了4种不同基因型的抗LAG-3的特异性人源单链抗体。随后通过真核表达系统构建出完整的抗LAG-3全人源单克隆抗体,生物学活性鉴定其中完整的LAG-3-2、LAG-3-8、LAG-3-13全人源单克隆抗体具有高特异性,且都可与激活的T细胞结合。