论文部分内容阅读
目的:本实验首先建立L6成肌细胞静止期(G0期)模型,细胞在G0期仍可被激活并重新进入细胞循环周期,以确保后续实验中细胞基本处于均衡一致状态,且活力尚可。在此基础,模拟成肌细胞应力加载模型,在宏观层面观察应力刺激成肌细胞体外生长时,细胞周期变化。从微观层面探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK Mitogen--Activated Proton Kinase)信号通路中p38 MAPK与JNK如何交互作用调节下游相关蛋白最终参与到周期调节中,为阐明颌面部肌肉适应性改建的机制提供依据,为功能矫形治疗提供理论支持。方法:实验对象为大鼠成肌细胞L6,传代培养后诱导细胞进入暂不分裂的休眠期,运用流式细胞术和蛋白免疫印迹法分别检测细胞周期改变和Ki67表达变化,确认基本所有细胞进入G0期。使用含10%胎牛血清的促增殖培养液激活细胞,使重新进入G1期。分别于6 h、12 h、18 h、24 h观察细胞数目及活力,提取样本,检测细胞周期的变化、增殖标志性蛋白Ki67及其他周期相关蛋白变化。将重新激活12 h的细胞分为对照组及加力组,加力组细胞施以周期性应力,时间分别为1 h、3 h、6 h、12 h,加载频率为10 cycles/min,张力幅度为15%细胞形变,对照组不加力。观察应力作用下细胞形态及排列方向的变化,检测两组细胞周期分布、p38 MAPK(p-p38 MAPK)与JNK(p-JNK)通路是否被激活(或抑制),同时检测其下游周期调控相关蛋白CyclinD1、p21、p57。最后,应用p38特异性抑制剂(SB203580)进一步明确p38与JNK交互作用及其对细胞周期的影响。结果:1.成功建立L6-G0期模型,流式结果示S期细胞数量低于2%,Western Blot结果显示细胞增殖标志性蛋白Ki67表达几乎完全抑制。2.转入含10%胎牛血清培养条件中分别孵育6 h、12 h、18 h、24 h,镜下可见细胞逐渐激活、密度增加,同时流式及Western Blot结果均显示细胞重新进入S期,并在12h呈现出增殖高峰。3.将激活12 h组细胞,按照上述参数加载应力,观察到细胞的排列会随应力刺激出现形状及排列方向变化。4.流式结果显示,与对照组相比,加力组中S期细胞比例下降,其中加力时间为3 h、6 h时差异有统计学意义。5.Western Blot中,p-p38 MAPK在受力细胞中表达显著升高,相反p-JNK在实验组表达适当降低。同时,实验组细胞CyclinD1表达低于对照组,p21及p57则表达升高。6.p38特异性抑制剂(SB203580)使用后,相对单纯加力组,抑制剂处理后的受力细胞增殖率无明显变化,p-p38表达骤减,相反JNK表达升高,同时伴随CyclinD1表达升高,而p21在抑制剂组表达量无明显下降。结论:特定的周期性应力通过激活p38MAPK通路,抑制下游CyclinD1表达,从而阻止细胞无限增殖;且p38MAPK与JNK存在交互对话,当p38MAPK活性抑制,JNK则明显被激活。有趣的是p38MAPK通路失活并未引起S期细胞比例剧增,推测在此过程中存在其他通路及蛋白参与到调节细胞周期中来。