论文部分内容阅读
背景:抑郁症（depression）是一种长期缓慢发展而又不断反复发作的慢性精神疾病,其主要特点表现为长期情绪低落、社会被孤立感和生活乐趣缺乏。WHO指出,抑郁症将会对个人生命质量问题和社会经济问题带来巨大挑战。因此,其发病机制和治疗措施急需深入研究。miRNA是一种非编码单链小RNA,参与调控转录后基因的表达。前期研究发现,不管是啮齿动物抑郁模型还是抑郁症病人都存在miRNA失调的现象。采用miRNA芯片技术分析发现,功能失调的miRNA家族参与了神经营养因子信号通路、AMPK信号通路、m TOR信号通路等,降低了海马可塑性并激活中枢炎症。基于骨骼肌收缩活动的多种锻炼方法,对抑郁症防治效果明显。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α）介导的“肌-脑Crosstalk”在运动抗抑郁中作用突出。miR-696是一种对运动敏感的miRNA,主要参与PGC-1α翻译调节和小鼠骨骼肌代谢。骨骼肌PGC-1α可诱导骨骼肌产生抗炎性因子并直接发挥抗炎效应,或是通过调节IL-10、核转录因子κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）信号发挥作用,这可能对抑郁症产生一系列积极影响。然而,运动诱导的骨骼肌适应与中枢炎症之间的“Crosstalk”调控机制有待进一步研究。目的:本研究基于简化急性色氨酸耗竭（Simplified acute tryptophan depletion,SATD）抑郁动物模型,探究跑台运动预适应对小鼠抑郁行为以及海马miRNA表达谱的影响,寻找介导抑郁行为调控的关键miRNA;进一步探究骨骼肌miRNA-696/PGC-1α/NF-κB通路介导运动抗抑郁的炎症反应机制,为运动预防抑郁症发生的可能途径提供理论依据。方法:将4周龄C57雄性小鼠,随机分为8组。根据研究目的分三部分进行。第一部分:NC组（对照组,灌胃等量生理盐水）和SATD组（抑郁模型组,灌胃不含色氨酸的中性氨基酸混合液）,旨在探讨SATD对抑郁行为的影响及机制。第二部分:SS组（SATD造模+注射等量生理盐水）和SSE组（6周跑台运动后,SATD造模+注射等量生理盐水）,旨在探讨运动预适应对SATD小鼠抑郁行为的影响及机制。第三部分:SAC组（SATD造模+腓肠肌注射miR-696对照剂）、SCE组（6周跑台运动后,SATD造模+腓肠肌注射miR-696对照剂）、SA组（SATD造模+腓肠肌注射miR-696激动剂）和SAE组（6周跑台运动后,SATD造模+腓肠肌注射miR-696激动剂）,旨在探讨运动预适应的作用是否依赖腓肠肌miR-696。SSE、SAE、SCE组运动方案如下:坡度0°,速度10 m/min,60min/天,6天/周,连续训练6周。跑台运动第六周腓肠肌注射miR-696对照剂、激动剂,单次注射50ul,5nmol/只。SS和SSE组注射等量生理盐水。第七周进行SATD造模:实验动物造模前15小时禁食,分两次（间隔90min）灌以不含色氨酸的中性氨基酸混合液。造模后5个小时进行行为学测试:强迫游泳实验（Forced Swim Test,FST）和悬尾实验（Tail Suspension Test,TST）,之后取血及组织样本。采用ELISA技术检测小鼠血清5-HT及炎症因子的含量;采用定量实时PCR和WES等技术检测miRNA-696/PGC-1α/NF-κB相关通路m RNA和蛋白表达。最后采用miRNA测序技术检测NC、SATD、SSE组小鼠海马脑区miRNA表达情况,并运用生物信息学方法进行差异miRNA筛选和富集通路分析。结果:（1）行为学结果显示,与NC组相比,在TST中,SATD小鼠的不动时间出现显著性上升（P＜0.05）。与SS组相比,在FST中,SSE小鼠的不动时间出现显著性下降（P＜0.05）,挣扎时间出现显著性上升（P＜0.05）;在TST中,SSE小鼠的不动时间出现显著性下降（P＜0.05）,挣扎时间出现显著性上升（P＜0.05）。在FST中,miR-696激动剂使小鼠不动时间出现显著性上升（P＜0.05）,挣扎时间出现显著性下降（P＜0.01）;在TST中,miR-696激动剂使小鼠不动时间出现显著性上升（P＜0.01）,挣扎时间出现显著性下降（P＜0.05）。ELISA结果显示,与NC对比,STAD小鼠海马5-HT含量出现显著性下降（P＜0.01）;与SS组对比,SSE小鼠海马5-HT含量出现显著性上升（P＜0.01）;miR-696激动剂使小鼠海马5-HT含量出现显著性降低（P＜0.05）。（2）miRNA-696/PGC-1α/NF-κB炎症通路相关的m RNA及蛋白结果:SATD小鼠腓肠肌PGC-1αm RNA水平出现显著性下降（P＜0.05）,血清CRP、IL-1β、NF-κB含量出现显著性上升（P＜0.01）,海马NF-κB m RNA水平出现显著性升高（P＜0.05）。运动预适应使SATD小鼠腓肠肌miR-696 m RNA水平出现显著性降低（P＜0.05）,PGC-1αm RNA水平出现显著性升高（P＜0.05）,血清CRP、IL-1β、NF-κB含量均出现显著性上升（P＜0.01）,海马miR-124、miR-696、PGC-1α、NF-κB m RNA水平出现显著性降低（P＜0.05）,海马p105/p50蛋白水平出现显著性下降（P＜0.05）。miR-696激动剂使小鼠血清CRP、IL-1β含量出现显著性升高（P＜0.01）,腓肠肌和海马PGC-1α、NF-κB m RNA水平和蛋白水平均没有显著性影响。（3）miRNA测序结果显示,与NC组对比,SATD组存在18个差异表达的miRNAs,其中表达上调的有13个,表达下调的有5个;与SATD组对比,SSE组存在8个差异表达的miRNAs,其中表达上调的有4个,表达下调的有4个;差异性miRNAs筛选标准为P＜0.05。与NC对比,SATD组miRNAs差异表达的靶基因主要参与细胞代谢过程、定位过程、信号调节过程、分解过程和蛋白组装过程等;与SATD组对比,SSE组miRNAs差异表达的靶基因主要参与代谢过程、大分子修饰过程、磷代谢过程、磷酸盐复合物相关过程、组装过程等。与NC组对比,SATD组miRNAs差异表达的靶基因参与的信号通路主要有突触囊泡循环、神经营养因子信号通路、m RNA监控通路、胰岛素信号通路、糖基磷脂酰肌醇的生物合成、轴突传导、ABC转运蛋白等;与SATD组对比,SSE组miRNAs差异表达的靶基因参与的信号通路主要有肌动蛋白细胞骨架的调节、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、戊糖和糖醛酸的相互转化、催产素信号通路、m TOR信号通路、胰岛素信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号传导等。结论:（1）SATD在一定程度上可以诱导小鼠产生抑郁行为;长期运动预适应可以阻止SATD诱导的抑郁行为,提示运动对抑郁的预防作用。（2）运动预适应可以激活骨骼肌PGC-1α,抑制NF-κB炎症信号通路;但骨骼肌miR-696干扰不能通过PGC-1α/NF-κB信号通路影响中枢炎症反应,可能通过其他途径参与运动的抗抑郁机制。（3）SATD和运动预适应可以引起小鼠海马miRNA表达谱的变化。这可能与突触囊泡循环、神经营养因子、肌动蛋白细胞骨架的调节、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等信号通路有关。