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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的新发的病毒性传染病。GP5蛋白是PRRSV的重要结构蛋白和免疫保护蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面具有重要意义,目前被认为是研制PRRS新型分子诊断试剂和新型疫苗的良好侯选材料。因此高效表达有活性的GP5蛋白是研究和探讨GP5蛋白本质和功能的基础,进一步为PRRS的防制提供理论依据。本研究利用RT-PCR从PRRSV河南分离株Hn-1/06克隆得到了大小约718bp片段的ORF5基因,并将扩增的基因片段克隆到pTG19-T载体中进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析,同时将该ORF5基因的核苷酸序列与ATCC VR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分离株进行了同源性分析,分析结果说明了PRRSV的同源性可能与空间距离密切相关,空间距离越近同源性越高。根据PRRSV ORF5测序结果设计三组针对ORF5的两端带有BamH I、HindⅢ酶切位点的特异性引物,这三组引物分别扩增了包括ORF5完整开放阅读框序列、删除信号肽的ORF5序列和同时删除信号肽与三个跨膜区的ORF5序列,长度分别为623bp、527bp和413bp的核苷酸片段,并将扩增的基因片段克隆到pTG19-T载体中测序,测序正确的三种质粒双酶切后,将目的片段分别亚克隆到原核表达载体pET32a中,并分别命名为pET32a-GP5-L、pET32a-GP5-W和pET32a-GP5abc,测序结果表明,成功构建含有PRRSV河南分离株Hn-1/06株ORF5基因的3个重组原核表达质粒。将构建的三个重组原核表达质粒pET32a-GP5-L、pET32a-GP5-W和pET32a-GP5abc,转化到大肠杆菌BL21中,在IPTG的诱导下,发现只有pET32a-GP5abc成功表达,获得了大小约为34KDa的GP5abc融合蛋白,与预期结果相符;并对表达条件进一步优化,大量表达,表达蛋白主要以包涵体形式存在,以尿素法对包涵体纯化;之后通过透析法对其复性,并通过经SDS-PAGE分析,目的蛋白可达到90%以上。之后经Western blot分析,证明融合蛋白具有良好的免疫原性和特异性。用GP5abc融合蛋白的包涵体、变性蛋白及复性蛋白分别免疫小鼠,获得针对GP5abc融合蛋白的鼠源抗体。通过建立的ELISA方法,对鼠源抗体进行检测,结果显示其抗体效价为1:20。利用猪抗PRRSV抗体作为一抗,用荧光素标记的羊抗猪抗体为二抗,在Marc-145细胞上,通过条件优化,建立了在细胞上检测PRRSV的间接免疫荧光方法(IFA)方法。用IFA方法,检测在PRRSV感染Marc-145细胞24h后,用鼠抗GP5bac蛋白抗体做一抗,可检测到较强的荧光。用IFA方法对鼠抗GP5abc抗体在Marc-145细胞上进行中和试验并用猪抗PRRSV抗体做阳性对照,结果发现鼠抗GP5abc抗体在Marc-145细胞上没有中和活性,而对照45天采集的猪抗PRRSV抗体有中和活性,中和效价为1:40。