引言间充质干细胞诱导成肝细胞样细胞用于肝细胞移植治疗,被认为是一种有效的肝病替代治疗。不同的培养维度影响hADMSCs成肝诱导效果,3D细胞球培养被认为是与体内微环境更相似的培养模型,除了增强干细胞干性,还能增强终末肝细胞样细胞的表型和功能,因此,探讨不同培养维度及培养维度转换对hADMSCs成肝诱导是非常必要的。组蛋白乙酰化在干细胞诱导分化中发挥重要作用,组蛋白H3第56位赖氨酸乙酰化（H3K56ac）修饰可以使得DNA的缠绕变松散,启动下游基因的转录。研究表明H3K56乙酰化调控人胚胎干细胞的多能性转录因子的表达,p300能调控H3K56乙酰化,使得染色质组装激活基因转录。我们前期研究发现,与2D诱导相比,3D细胞球诱导的肝细胞样细胞的ALB在转录水平发生明显的变化,而组蛋白乙酰化是在表观遗传学上调控基因的激活转录,为此,我们将hADMSCs 2D和3D诱导的肝细胞样细胞进行乙酰化修饰蛋白质组学检测,结果发现3D诱导的H3K56乙酰化水平显著高于2D诱导。但不同培养维度及维度转换是否通过p300调控H3K56乙酰化,激活肝细胞样细胞ALB基因转录,从而促进hADMSCs成肝诱导,其潜在的分子机制,国内外尚未见报道。本课题主要研究不同培养维度和培养维度转换对hADMSCs成肝诱导的影响,进一步探讨p300调控H3K56乙酰化在不同培养维度和培养维度转换的肝细胞样细胞中的有关表观遗传学作用机制,通过药物筛选平台和组织工程应用来研究培养维度转换对hADMSCs成肝诱导的效果,为hADMSCs诱导分化成肝细胞样细胞提供新的方案,也为肝细胞药物筛选和肝细胞移植治疗提供新的技术支持和应用前景。第一部分hADMSCs在不同培养维度下诱导成肝细胞样细胞表型变化及其表观遗传学机制目的:通过研究hADMSCs在不同培养维度下诱导成肝细胞样细胞的表型变化,探讨有关的表观遗传学机制。方法:1.不同培养维度对hADMSCs成肝诱导的影响（1）hADMSCs的分离提取和鉴定:I型胶原酶消化人脂肪组织提取hADMSCs。显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测hADMSCs表面标志蛋白,茜素红和油红O染色分别检测hADMSCs成骨和成脂分化。（2）hADMSCs不同培养维度下多能性转录因子的表达:（1）琼脂糖微孔3D细胞球的构建。（2）RT-qPCR和Western blot检测多能性转录因子Sox2、Oct4和Nanog的表达。（3）hADMSCs在不同培养维度下诱导成肝细胞样细胞:显微镜观察诱导过程中细胞形态。Live/Dead染色检测诱导后的细胞活性。RT-qPCR,Western blot和IF检测肝细胞样细胞相关基因的mRNA和蛋白表达。ELISA和定量比色法分别检测细胞上清白蛋白和尿素的含量。PAS染色法检测细胞的糖原合成。2.不同培养维度影响hADMSCs成肝诱导效应的表观遗传学机制（1）hADMSCs不同培养维度诱导的肝样细胞的乙酰化修饰蛋白质组学检测,筛选出显著差异表达的乙酰化修饰组蛋白,再用生物信息学分析方法进行蛋白的功能注释和富集分析等。（2）Western blot和IF验证筛选出的靶蛋白H3K56乙酰化水平差异;ChIP-qPCR检测H3K56ac对ALB基因启动子区域富集效率。（3）p300在hADMSCs不同培养维度成肝诱导中的作用:（1）筛选出A-485抑制成肝最显著的作用浓度和时间。（2）实验分为2D-DMSO、2D-A-485、2D-CTB、3D-DMSO、3D-A-485、3D-CTB六组,RT-qPCR检测各组mRNA表达;Western blot和IF检测各组ALB、AFP、Sox2、Oct4蛋白表达和H3K56ac水平;ELISA和定量比色法检测各组白蛋白和尿素分泌;PAS糖原染色检测各组糖原生成。结果:1.不同培养维度对hADMSCs成肝诱导的影响（1）成功提取hADMSCs:细胞呈长梭形纤维细胞样形态、旋涡状排列且增殖快;细胞表达间充质表面标志蛋白CD44,CD90和CD105,不表达造血干细胞标志蛋白CD34,CD45和组织相容性抗原II类HLA-DR;细胞能进行成骨和成脂诱导分化,符合间充质干细胞表型特征。（2）3D培养显著升高hADMSCs的Sox2、Oct4、Nanog的mRNA和蛋白表达水平。（3）hADMSCs在成肝诱导21天后,细胞形态由纤维样长梭形变成多边形,且无论是2D还是3D诱导,其肝样细胞都具有较高的细胞活性;与2D诱导相比,3D诱导显著上调肝相关基因ALB、CK18、CYP1A2、CYP3A4的mRNA表达和ALB蛋白表达,显著下调AFP的mRNA和蛋白表达;3D诱导显著增加肝样细胞白蛋白、尿素分泌和细胞内糖原的合成。2.不同培养维度影响hADMSCs成肝诱导效应的表观遗传学机制（1）根据乙酰化修饰蛋白质组学检测的结果,筛选出了显著上调的与调控基因转录激活有关的H3K56ac和调控H3K56乙酰化的乙酰转移酶p300,且H3K56ac与p300存在直接的蛋白互作关系。（2）与2D-HLCs相比,3D-HLCs显著升高H3K56的乙酰化水平,且上调ALB蛋白表达和下调AFP蛋白表达。3D-HLCs显著升高ALB基因启动子区域H3K56的乙酰化水平。（3）p300在hADMSCs不同培养维度成肝诱导中的作用:（1）对于2D诱导:与DMSO正常诱导相比,p300抑制剂A-485显著抑制hADMSCs诱导为多边形的肝细胞样细胞形态,p300激活剂CTB促进细胞形态向多边形转变;A-485显著降低ALB蛋白表达及H3K56ac水平和升高Sox2的蛋白表达,CTB显著升高H3K56ac水平和下调ALB、AFP蛋白表达;A-485显著抑制白蛋白、尿素的分泌和细胞内糖原合成,CTB显著升高尿素分泌水平。（2）对于3D诱导:与DMSO正常诱导相比,A-485显著降低ALB蛋白表达、H3K56ac水平和升高Sox2蛋白表达水平,CTB却没有升高H3K56ac和ALB蛋白表达水平;A-485显著抑制白蛋白、尿素的分泌,CTB显著升高白蛋白和尿素分泌水平。结论:hADMSCs在不同培养维度下成功诱导成肝细胞样细胞,且3D诱导增强成肝诱导效应,其机制为:p300调控H3K56乙酰化,激活ALB转录,促进hADMSCs3D成肝诱导。第二部分hADMSCs在培养维度转换后诱导成肝细胞样细胞表型变化及其表观遗传学机制目的:通过研究hADMSCs在培养维度转换后诱导成肝细胞样细胞表型变化,探讨其潜在的表观遗传学机制。方法:1.培养维度转换对hADMSCs成肝诱导的影响实验分为四组:将hADMSCs在不同培养维度（2D,3D）下诱导成的肝细胞样细胞进行培养维度转换,2D诱导分别转为2D培养（2D-2D）和3D培养（2D-3D）、3D诱导分别转为2D培养（3D-2D）和3D培养（3D-3D）。RT-qPCR检测各组细胞肝相关基因ALB、AFP、HNF-4a、CYP1A2和CYP3A4的mRNA表达。Western blot和IF检测ALB、AFP、Sox2和Oct4的蛋白表达;ELISA和定量比色法分别检测上清白蛋白和尿素的含量;PAS糖原染色法检测细胞内糖原生成。2.培养维度转换影响hADMSCs成肝诱导的表观遗传学机制（1）Western blot检测培养维度转换后的四组肝样细胞的p300蛋白表达和H3K56ac水平。（2）p300对2D-3D转换的肝样细胞的影响:实验分为2D-3D-DMSO、2D-3D-A-485、2D-3D-CTB三组,RT-qPCR检测各组ALB、CYP1A2和CYP3A4 mRNA表达;Western blot和IF检测各组ALB、AFP、Sox2和Nanog的蛋白表达和H3K56ac水平;ELISA和定量比色法检测各组上清白蛋白和尿素的分泌。结果:1.培养维度转换对hADMSCs成肝诱导的影响与其他三组相比,2D-3D组显著上调ALB、HNF-4a、CYP1A2和CYP3A4的mRNA表达和ALB蛋白表达;显著下调AFP mRNA和蛋白表达;显著降低Sox2,Oct4蛋白表达水平;显著升高白蛋白、尿素含量和增加细胞内糖原合成。2.培养维度转换影响hADMSCs成肝诱导的表观遗传学机制（1）与培养维度转换后的其他三组相比,2D-3D组的p300蛋白表达和H3K56ac水平显著升高。（2）与2D-3D-DMSO组相比,A-485显著降低2D-3D组的肝特异基因ALB、CYP1A2和CYP3A4的mRNA水平,显著下调ALB蛋白表达、H3K56ac水平和上调AFP蛋白表达,显著降低细胞白蛋白和尿素的含量;CTB没有明显的上调ALB蛋白表达和H3K56ac水平,也没有升高白蛋白和尿素的水平。结论:2D-3D培养维度转换增加肝细胞样细胞的特异性基因的表达,增强细胞功能,促进肝样细胞成熟,从而促进hADMSCs成肝诱导,其机制可能与p300调控H3K56乙酰化有关。第三部分培养维度转换后hADMSCs诱导成肝细胞样细胞的应用研究目的:通过药物筛选平台和组织工程来研究培养维度转换后的肝细胞样细胞的应用效应,验证2D-3D培养维度转换促进hADMSCs成肝诱导。方法:1.药物筛选平台研究（1）药物毒性:将培养维度转换的四组肝细胞样细胞分别加入不同浓度梯度的对乙酰氨基酚和胺碘酮,孵育48 h后,Cell Titer-Glo（?）3D细胞活性试剂盒检测各孔细胞发光值。（2）药物代谢:向培养维度转换的四组肝细胞样细胞中加入CYP3A4酶诱导剂利福平（25μM）,作用48 h后,再加入CYP3A4酶底物睾酮（100μM）,作用48 h,RT-qPCR检测这四组细胞中的CYP3A4的mRNA表达水平;P450-GloTM CYP450试剂盒测定四组细胞的肝药酶CYP3A4酶活性;HPLC法检测四组细胞上清中睾酮及代谢产物6β-羟基睾酮的含量。2.组织工程研究（1）双通道海藻酸钠纤维和支架的构建:利用3D同轴生物打印技术打印双通道海藻酸钠纤维和支架,光学显微镜和扫描电镜对其参数进行表征。（2）负载细胞的双通道海藻酸钠纤维和支架灌流:用Live/Dead染色检测纤维或支架内细胞活性,CCK8检测纤维内细胞增殖,ELISA检测负载HepG2细胞纤维培养基中白蛋白、尿素含量和负载Min6细胞纤维培养基中胰岛素含量,IF检测负载HepG2细胞纤维中ALB蛋白表达和负载Min6细胞纤维中PDX-1蛋白表达。（3）双通道纤维灌流模拟Min6和HepG2相互作用:1%type I Collagen/Min6（Min6组）和1%Na-Alg/HepG2（HepG2组）分别单独注入到双通道管状纤维的一侧作为对照组,1%type I Collagen/Min6和1%Na-Alg/HepG2都注入到双通道纤维的一侧作为实验组（Min6+HepG2组）,高糖培养基灌流24 h后,ELISA测定流出液中各时间点的胰岛素含量,葡萄糖、丙酮酸试剂盒测定各时间点的葡萄糖、丙酮酸含量,灌流结束后,2-NBDG摄取实验检测各组细胞内葡萄糖的摄取。（4）双通道纤维灌流验证培养维度转换对hADMSCs成肝诱导效果:2D-3D和3D-3D分别与1%Na-Alg混合成细胞水凝胶,分别接种到双通道纤维中,静态培养和动态灌流培养48 h,Western blot检测各组细胞的ALB和AFP蛋白表达,ELISA和定量比色法分别检测培养流出液中的白蛋白和尿素的含量。结果:1.药物筛选平台研究（1）与L02和HepG2阳性对照组相比,只有2D-3D组的对乙酰氨基酚和胺碘酮的IC50与3D的L02或者HepG2的IC50接近。（2）与其他三组相比,2D-3D组显著增加CYP3A4的mRNA表达和CYP3A4酶活性。各组培养基中剩余的睾酮百分比分别为:2D-3D为9.1±0.75%,2D-2D为39.2±1.07%,3D-2D为55.3±1.2%,3D-3D为12.9±0.81%,说明2D-3D组代谢了约90%睾酮,显著高于其他三组,表明2D-3D组代谢睾酮的能力最强,间接说明2D-3D组CYP3A4酶活性最强,和前面的2D-3D组的CYP3A4 mRNA水平和酶活性最高的结果一致。2.组织工程研究（1）流动测试实验证实了同轴打印的双通道海藻酸钠纤维为中空结构。一侧通道负载细胞水凝胶,另一侧通道灌流培养基,且两通道间由海藻酸钠壁隔开,其厚度约为50μm,利于培养液物质转运。（2）双通道纤维接种1%Na-Alg水凝胶封装HepG2细胞,与未灌流相比,灌流组显著提高HepG2细胞活性、ALB蛋白表达以及白蛋白、尿素的分泌功能;双通道纤维接种1%type I Collagen水凝胶封装Min6细胞,与未灌流比,灌流也显著提高Min6细胞活性和PDX-1蛋白表达。1%Na-Alg/HepG2接种在8层立方体双通道海藻酸钠支架中,其细胞活性随着灌流液营养物质和氧气的减少而逐渐降低。（3）双通道纤维灌流模拟Min6和HepG2相互作用实验中,Min6+HepG2组的胰岛素水平与Min6组相比显著下降,且Min6+HepG2中的葡萄糖水平显著低于Min6组或HepG2组。Min6+HepG2组中HepG2细胞葡萄糖摄取能力显著高于Min6组和HepG2组。（4）在未灌流和灌流的双通通道海藻酸钠纤维中的2D-3D组肝细胞样细胞的ALB蛋白表达显著高于3D-3D组、AFP蛋白表达显著低于3D-3D组,2D-3D组白蛋白和尿素的含量都显著高于3D-3D组。与2D-3D未灌流相比,2D-3D灌流显著降低AFP蛋白表达,升高白蛋白和尿素水平。结论:（1）药物毒性实验和药物代谢实验验证了2D-3D培养维度转换促进hADMSCs成肝诱导。（2）成功构建了具有生物相容性、可灌流性和可用性的双通道海藻酸钠纤维,双通道海藻酸钠纤维3D动态培养模型进一步验证了2D-3D培养维度转换促进hADMSCs成肝诱导。