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研究目的:盐诱导激酶1（salt inducible kinase 1,SIK1）是AMP活化蛋白激酶相关激酶（AMP-activated protein kinase relative kinase,AMPKRK）家族成员之一,调控多种机体代谢相关生理活动。然而,SIK1对肝脏和骨骼肌糖代谢的调控还存在很多未知之处,同时,能够激活SIK1的小分子化合物也鲜有报道。本实验室前期研究发现,天然产物phanginin A具有肝糖异生抑制作用,该作用与phanginin A激活SIK1进而激活PDE4终止c AMP/PKA/CREB信号通路相关;同时,phanginin A长期口服给药后对2型糖尿病ob/ob小鼠也具有较好的治疗作用。因此,phanginin A是本实验室首次报道的可激活SIK1的小分子化合物,同时也是一个具有开发潜力的抗2型糖尿病活性先导化合物。本论文的第一部分将对化学合作课题组合成的phanginin A衍生物Fwo-143抑制肝糖异生的作用进行系统研究,明确Fwo-143对SIK1的激动活性及其与肝糖异生抑制作用的相关性,并考察Fwo-143对2型糖尿病小鼠的降糖作用,评价Fwo-143作为抗2型糖尿病新药候选化合物的发展潜力。本论文的第二部分将以phanginin A为探针,研究SIK1激活对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的调控作用及其分子机制,为深入理解SIK1在骨骼肌能量代谢调控中的作用提供新的线索和依据。实验方法:采用原代培养小鼠肝细胞模型,评价Fwo-143对肝糖异生的调控作用。采用ELISA试剂盒检测Fwo-143对细胞环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate,AMP）含量的影响。采用免疫印迹法检测环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMPresponse element binding protein,CREB）和SIK1的磷酸化水平。采用SIK广谱抑制剂研究SIK1激活与Fwo-143抑制糖异生的相关性。在2型糖尿病ob/ob小鼠模型上评价Fwo-143长期口服给药后的治疗作用,并采用免疫印迹法分析Fwo-143长期给药后对ob/ob小鼠肝脏SIK1和CREB磷酸化的作用。采用C2C12小鼠肌管细胞研究phanginin A对骨骼肌葡萄糖摄取的调控作用。采用real-time q PCR检测phanginin A对骨骼肌组织或细胞中葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4,GLUT4）、肌细胞增强因子2a（myocyte enhancer factor2a,MEF2a）和片珠蛋白（junction plakoglobin,JUP）m RNA表达的调控作用。采用免疫印迹法分析phanginin A对C2C12细胞SIK1、组蛋白去乙酰化酶4/5/7（histone deacetylase 4/5/7,HDAC4/5/7）、蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）和160 k Da的Akt底物（Akt substrate of 160 k Da,AS160）磷酸化以及对GLUT4的总蛋白水平及膜上蛋白水平的调控作用。采用SIK广谱抑制剂和si RNA介导的SIK1干扰技术研究SIK1激活与phanginin A促进C2C12细胞葡萄糖摄取的相关性。采用肝脏激酶B1（liver kinase B1,LKB1）干扰技术探索phanginin A激活SIK1及其促进葡萄糖摄取作用与LKB1的相关性。采用PI3K抑制剂和Akt抑制剂探索PI3K/Akt信号通路激活与phanginin A促进骨骼肌细胞葡萄糖摄取的相关性。采用JUP干扰技术探索phanginin A激活Akt及其促进骨骼肌细胞葡萄糖摄取与JUP的相关性。观察C57BL/6J小鼠长期口服给与phanginin A后骨骼肌组织中SIK1激活及对骨骼肌糖代谢和利用的调控作用。实验结果:Phanginin A衍生物Fwo-143能够显著抑制小鼠原代肝细胞糖异生,促进肝细胞SIK1的磷酸化,降低细胞内c AMP水平,抑制CREB磷酸化。SIK抑制剂HG-9-91-01可逆转Fwo-143对小鼠原代肝细胞糖异生的抑制作用。2型糖尿病ob/ob小鼠经Fwo-143长期给药处理后,肝脏SIK1磷酸化水平显著上调,CREB磷酸化水平显著下调,且ob/ob小鼠的随机血糖和空腹血糖均明显下降,提示Fwo-143对2型糖尿病ob/ob小鼠具有显著治疗作用。Phanginin A能够显著促进C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取,并可同时增加细胞内GLUT4的表达和促进细胞内GLUT4的上膜。Phanginin A可显著增加C2C12小鼠肌管细胞SIK1蛋白磷酸化水平,同时,SIK广谱抑制剂HG-9-91-01和干扰SIK1均可阻断phanginin A对C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取的促进作用。干扰C2C12小鼠肌管细胞内LKB1的表达可阻断phanginin A对SIK1的激活作用,同时,phanginin A促进葡萄糖摄取作用也被阻断。Phanginin A能够促进C2C12小鼠肌管细胞HDAC4/5/7磷酸化并进而增加MEF2a和GLUT4表达,该作用可被SIK1干扰完全阻断。Phanginin A能够促进C2C12小鼠肌管细胞JUP的表达,进而激活Akt/AS160信号通路;PI3K及Akt抑制剂能够逆转phanginin A对葡萄糖摄取的促进作用;干扰JUP能够阻断phanginin A对Akt/AS160磷酸化和葡萄糖摄取的促进作用;且干扰SIK1也可阻断phanginin A对JUP表达和Akt/AS160磷酸化的促进作用。Phanginin A长期口服给药后可显著增加C57BL/6J小鼠骨骼肌组织中SIK1和HDAC4/5/7的磷酸化水平,并增加MEF2a、GLUT4和JUP表达,激活Akt/AS160信号通路,促进GLUT4转位上膜,并可显著增加骨骼肌组织中糖原合成和糖酵解基因的表达。研究结论:本论文研究发现,phanginin A衍生物Fwo-143能够显著增加原代小鼠肝细胞SIK1磷酸化,抑制c AMP/CREB信号通路,并进而抑制原代小鼠肝细胞糖异生功能。Fwo-143对2型糖尿病ob/ob小鼠具有良好的治疗作用,具备成为抗2型糖尿病新药候选化合物的潜力。本论文研究还发现,phanginin A促进C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取与其激活SIK1相关。SIK1激活后可通过磷酸化HDAC4/5促进MEF2a的表达,并进而促进细胞内GLUT4的表达;同时,SIK1激活后还可通过磷酸化HDAC7促进JUP的表达,激活Akt/AS160信号通路,并进而促进GLUT4转位上膜。本论文以phanginin A为探针,初步阐明了SIK1激活后可通过增加GLUT4蛋白表达和促进GLUT4上膜的双重机制发挥对C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取的促进作用,为深入理解SIK1参与调控骨骼肌葡萄糖摄取提供了新的线索和实验依据。