研究背景:胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一,是全球癌症死亡的第二大原因,其预后较差,严重威胁人类健康^[1]。早在1938年国外病理专家提出了胃肠化生与癌症之间的联系^[7],近年来国内有关慢性萎缩性胃炎患者的随访研究发现轻度异型增生及肠化生的癌变率分别是2.27%-4.26%^[8],重度异型增生及肠化生的癌变率分别是25%-9.09%^[9]。由此可见从正常胃黏膜-慢性非萎缩性胃炎-慢性萎缩性胃炎-胃黏膜肠上皮化生-上皮内瘤变发展至浸润性胃癌,经历了长期的多步骤演变,胃腺癌发展进程中有一个较长的癌前过程^[10]。胃癌前病变是较易发生癌变的胃黏膜病理组织学改变,是从良性上皮组织转变成癌过程中的交界性病理变化^[4]。在这一过程中需要对“炎-癌”转化进行动态预警和癌症干预阻断,临床上运用中医药减少炎症刺激对胃黏膜的损伤,将显著降低胃癌的发生率和死亡率。p62/SQSTM1作为自噬受体识别泛素化底物,能够去除细胞内功能异常的聚合蛋白、损伤或过剩的蛋白、细胞器等,在选择性自噬中扮演着重要角色。同时自噬基因p62作为一种与非典型蛋白激酶C（a PKCs）相互作用的蛋白质,可以诱导NF-κB信号通路的调控与活化,从而调控炎症反应、凋亡基因、氧化应激甚至肿瘤进展,而这一机制在胃癌前病变发展及癌变转归过程中所起作用机制需进一步探索。基于此,本文在前期研究基础上,运用动物模型,探讨胃痞消对MNNG诱导的胃癌前病变大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其内在的分子机制。目的:1.本实验采用MNNG联合饥饱失常造模法建立胃癌前病变大鼠模型,观察胃痞消对胃癌前病变大鼠一般情况的影响,同时探讨胃痞消对胃癌前病变大鼠腺体萎缩、肠上皮化生以及异型增生的防治效应;2.观察MNNG诱导胃癌前病变大鼠轻中度病变阶段,探讨胃痞消改善胃癌前病变大鼠恶性病变及减轻胃癌前病变大鼠胃黏膜炎性损伤,调控胃癌前病变大鼠p62/RIP1-NF-κB信号通路在抗炎以及诱导凋亡保护胃黏膜的可能作用机制。方法:将70只SD大鼠随机分为正常组（n=13）和造模组（n=57）,正常组常规饲养,造模组给予200μg/ml MNNG自由饮+隔日禁食法复制脾虚型胃癌前病变大鼠模型。分别于造模第8周,12周和16周随机选取3只造模组大鼠和1只正常组大鼠,取胃小弯体-窦交界处的胃黏膜,HE染色并观察其病理组织学变化,第16周造模组大鼠出现异型增生病变。MNNG造模16周后,将造模组随机分为模型组,胃复春组（0.2g/kg）,胃痞消高剂量组（19.8g/kg,2倍临床等效剂量）和胃痞消低剂量组（9.9g/kg,1倍临床等效剂量）,正常组和模型组灌胃蒸馏水10ml/kg,连续灌胃10周,于第26周末实验结束后取胃小弯侧体一窦交界处胃窦侧胃黏膜,一部分中性福尔马林固定,制备病理组织切片,进行HE、HID-AB-PAS染色下观察病理学病变;刮取剩余大鼠胃窦部胃黏膜,采用Western Blot法、荧光定量PCR法、ELISA检测相关指标。（一）胃痞消对胃癌前病变大鼠病理组织形态学的影响1.采用HE染色观察胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织形态变化的影响;2.采用HID-AB-PAS染色观察胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜肠上皮化生的影响。（二）胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织凋亡诱导作用研究1.采用免疫组化法检测胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织CDX2、MUC2蛋白表达的影响;2.采用Western Blot法检测胃痞消调控胃癌前病变大鼠胃黏膜组织凋亡活性。（三）胃痞消减轻胃癌前病变大鼠胃黏膜损伤中的抗炎作用研究1.采用ELISA检测胃癌前大鼠胃黏膜组织TNF-α和IL-1β含量的变化;2.采用Western Blot法检测胃痞消调控胃癌前病变大鼠胃黏膜组织NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。（四）胃痞消介导p62/RIP1-NF-κB信号通路延缓胃癌前病变大鼠恶性病变1.采用RT-qPCR法检测胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织p62、RIP1基因水平的影响;2.采用Western Blot法检测胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织p62、RIP1蛋白表达水平的影响。结果:（一）胃痞消对胃癌前病变大鼠病理组织形态学的影响胃痞消中药复方能有效改善胃癌前病变大鼠脾虚症状,同时在改善胃黏膜组织病理学方面也有显著优势。胃癌前病变大鼠经过10周胃痞消灌胃治疗后,通过胃黏膜组织HE染色我们发现,胃痞消各剂量组大鼠胃黏膜呈粉红色,光泽度欠佳;胃黏膜上皮组织多见良性反应增生性改变,较模型组胃组织腺体排列相对整齐,腺体形态尚规则,少见“背靠背”或复层改变;胃黏膜上皮可见部分杯状细胞,基底侧可见细胞核深染、增大、重叠、极性减弱,细胞核仁突出,见明显核分裂现象及间质水肿、充血,伴有少量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润,但较模型组明显减轻。HID-AB-PAS染色观察可见胃痞消各剂量组大鼠肠上皮化生区域减少;而胃痞消可能通过改善主、壁细胞分泌功能,缓解胃黏膜萎缩、肠上皮化生和异型增生性病变,延缓乃至逆转胃黏膜恶性进展,防治其恶变为侵袭性胃腺癌。（二）胃痞消诱导胃癌前病变大鼠胃黏膜组织凋亡的机制研究1.胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织CDX2、MUC2蛋白表达水平的影响免疫组化结果显示,与模型组相比,胃痞消高、胃痞消低剂量组胃癌前病变大鼠胃黏膜组织CDX2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与模型组相比,胃痞消高、胃痞消低剂量组胃癌前病变大鼠胃黏膜组织MUC2蛋白表达显著降低（P<0.01）。2.胃痞消调控胃癌前病变大鼠胃黏膜组织凋亡活性Western Blot检测结果显示,与模型组相比,胃痞消高、胃痞消低剂量组GPL大鼠胃黏膜组织Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.01）,Bcl-XL蛋白表达水平显著降低（P<0.01,P<0.05）;模型组Caspase3蛋白表达水平较空白组明显减少（P<0.01）;胃痞消高、胃痞消低剂量组对GPL大鼠胃黏膜组织Bad蛋白水平的影响并不显著,差异无统计学意义（P>0.05）。（三）胃痞消减轻胃癌前病变大鼠胃黏膜损伤中的抗炎作用研究1.胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织炎症因子TNF-α和IL-1β含量水平的影响:ELISA检测结果显示,与模型组相比,胃痞消高、胃痞消低剂量组大鼠胃黏膜组织TNF-α含量明显减少（P<0.05,P<0.05）;胃痞消高、胃痞消低剂量组大鼠胃黏膜组织IL-1β含量显著降低（P<0.05,P<0.05）。2.胃痞消调控胃癌前病变大鼠胃黏膜组织NF-κB信号关键蛋白表达Western Blot检测结果显示,与模型组相比,胃痞消低剂量组大鼠胃黏膜组织NF-κB信号通路相关蛋白p-IKK、p-IKB、p-NF-κB的蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;胃痞消高剂量组大鼠胃黏膜组织NF-κB信号通路相关蛋白p-IKK、p-NF-κB的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。胃痞消高、胃痞消低剂量组对大鼠胃黏膜组织IKK、IKB、NF-κB蛋白表达影响并不显著,差异无统计学意义（P>0.05）。（四）胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织p62、RIP1表达水平的影响1.胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织p62和RIP1基因表达水平的影响RT-qPCR检测结果显示,与模型组相比,胃痞消高、胃痞消低剂量组胃黏膜组织p62基因水平显著降低（P<0.05,P<0.05）。与模型组相比,胃痞消低剂量组RIP1基因表达水平明显下降（P<0.05）。2.胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织p62和RIP1蛋白表达水平的影响Western Blot检测结果显示,与模型组相比,胃痞消低剂量组胃癌前病变大鼠胃黏膜组织p62蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与模型组相比,胃痞消高、胃痞消低剂量组RIP1蛋白表达水平明显下降（P<0.01,P<0.05）。结论:1.通过对胃癌前病变大鼠病理组织形态学观察可见,胃痞消可能通过改善胃癌前病变大鼠主、壁细胞组织学病变,缓解胃黏膜萎缩、肠上皮化生和异型增生性病变,延缓胃黏膜恶性进展,防止其恶变为侵袭性胃腺癌;2.生化指标检测表明,胃痞消可通过介导p62/RIP1-NF-κB信号通路诱导轻中度异型增生期胃癌前病变大鼠胃黏膜组织凋亡活性,恢复凋亡与增殖平衡,进而达到保护胃黏膜的作用;3.在轻中度胃癌前病理改变阶段,胃癌前病变大鼠胃黏膜组织炎性增生,胃痞消通过调控p62/RIP1-NF-κB通路发挥抗炎作用,诱导凋亡,启动胃黏膜保护级联反应,逆转肠上皮化生和异型增生性病变从而达到治疗作用;4.胃痞消有望给在慢性萎缩性胃炎基础上的肠化以及异型增生病变带来新的治疗策略,延缓或逆转胃黏膜恶性进展,保护胃黏膜,然而更深入的机制有待进一步的研究。总之,健脾化瘀解毒中药方胃痞消可通过调控p62/RIP1-NF-κB信号通路,诱导轻中度病变期大鼠凋亡,并抑制胃黏膜组织炎症反应,异常生物学分子未进行性累积,炎性损伤和癌性增生因素减少,癌前病变未进行性进展,有效防治了继发性胃黏膜萎缩、肠化和异型增生性病变,对胃癌前病变的治疗及恶性进展起到了决定性作用,对预防浸润性胃癌以及侵袭性胃腺癌的发生具有重要意义;同时在胃癌前病变癌性增生阶段的侵袭迁移还需实验证明,其信号转导机制及胃痞消干预效应仍有待进一步研究。