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目的:原发性肝癌是世界上最常见且致死率最高的肿瘤之一,肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是其最常见的类型,约占75-85%。目前虽然有多种治疗HCC的手段,如肝移植、外科手术切除、介入化学栓塞或物理消融治疗、靶向治疗、免疫治疗,但是HCC的早期症状隐匿,大多数患者确诊时已是中晚期,总体治疗疗效不佳,因此,需要研发新的诊断生物标志物和治疗靶点,以提高HCC的早期确诊能力和治疗疗效。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的RNA,几乎没有蛋白质编码能力,主要是和DNA、RNA、蛋白质之间进行相互作用调控基因表达。多项研究证明了lncRNA通过影响细胞增殖,迁移,侵袭,凋亡以及血管生成在HCC的发生、发展中发挥重要作用。另外,lncRNA具有良好的特异性,部分lncRNA可以稳定存在于体液中,具有良好的获得性。因此,lncRNA被认为有潜力成为HCC的诊断及疗效判断的新的生物标志物,也可能成为其新的治疗靶点。经皮肝动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）是通过导管向肿瘤供血动脉注入栓塞剂,栓塞肿瘤,使其缺血坏死,同时注入化疗药物,提高局部化疗药物浓度,更好杀灭肿瘤,减少全身化疗的不良反应。TACE治疗已广泛用于治疗HCC,是中晚期HCC主要治疗手段。TACE治疗会引起HCC的缺血坏死,进而引起与HCC相关的lncRNA发生变化,而lncRNA存在于血液中,相对于组织标本,血液标本比较容易获得,且创伤小,风险小,可重复性强。我们计划通过RNA测序分析行TACE治疗前后HCC患者血清内lncRNA变化,找出表达差异的lncRNA,寄希望于发现影响HCC发生发展的lncRNA,并进一步研究其调控HCC的分子机制,为HCC的早期诊断及疗效评估提供新的生物标志物,为HCC的治疗提供新的治疗靶点。本研究将从TACE治疗前后HCC患者血清lncRNA表达变化的研究,lncRNA620512对HCC功能学作用的研究以及lncRNA620512通过内源性竞争miR-6856-5p调控ZNF671抑制HCC的机制研究这三个部分进行探讨。方法:1.TACE治疗前后HCC患者血清lncRNA表达变化的研究（1）研究对象源于中国医科大学附属盛京医院第一介入病房,选择了2018年3月-2019年3月期间所收治的35例行TACE治疗HCC患者,分别于治疗前1天及治疗后1个月抽取血清;（2）应用RNA测序技术检测其中5例行TACE治疗HCC患者的血清,寻找表达差异的lncRNA;（3）应用qRT-PCR检测剩余30例行TACE治疗HCC患者血清,验证已发现的表达差异lncRNA;（4）应用qRT-PCR检测已发现的表达差异lncRNA在HCC细胞与健康肝细胞中表达水平。2.lncRNA620512对HCC功能学的作用（1）慢病毒转染lncRNA620512表达较低的HCC细胞系Hep G2和Hep3B,上调lncRNA620512表达,并通过qRT-PCR检测转染效率;（2）lncRNA620512对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的作用通过CCK-8细胞增殖实验及Transwell实验进行检测;（3）应用Hep3B细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验,检测lncRNA620512对HCC体内生长的作用;（4）对裸鼠皮下肿瘤进行HE染色和Ki67染色。3.lncRNA620512通过内源性竞争miR-6856-5p调控ZNF671抑制HCC的机制研究（1）应用RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）对lncRNA620512进行亚细胞定位,预测lncRNA620512抑制HCC的分子机制;（2）应用生信分析预测lncRNA620512下游靶基因;（3）应用qRT-PCR检测lncRNA620512及其预测的下游miRNA、m RNA的表达量;（4）应用双荧光素酶实验验证lncRNA620512与预测下游基因结合情况;（5）质粒转染预测的miRNA;（6）下游miRNA对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的作用通过CCK-8细胞增殖实验及Transwell实验进行检测;（7）下游靶蛋白表达水平通过Western Blot进行检测;（8）lncRNA620512与下游靶基因的相互关系通过挽救实验进行检测;（9）对裸鼠皮下肿瘤进行免疫组化分析。结果:1.lncRNA620512在HCC患者TACE治疗后血清中表达量显著升高,在HCC细胞系中低表达（1）通过RNA测序技术分析5例行TACE治疗HCC患者治疗前1天及治疗后1个月血清,我们发现ENST00000620512.1在TACE治疗后升高;（2）对剩余30例行TACE治疗HCC患者治疗前1天及治疗后1个月的血清进行qRT-PCR检测,结果证实ENST00000620512.1在TACE治疗后表达升高,我们命名ENST00000620512.1为lncRNA620512;（3）lncRNA620512在HCC细胞系中的表达低于在健康肝细胞系中的表达。2.lncRNA620512抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长（1）qRT-PCR结果显示lncRNA620512过表达的转染效率良好;（2）CCK-8细胞增殖实验及Transwell实验结果显示lncRNA620512过表达组HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力低于阴性对照组;（3）在裸鼠皮下成瘤实验中,lncRNA620512过表达组肿瘤重量及体积均低于阴性对照组;（4）对裸鼠皮下肿瘤进行Ki67染色,结果显示lncRNA620512显著降低了皮下肿瘤中Ki67表达水平。3.lncRNA620512通过内源性竞争miR-6856-5p调控ZNF671,进而调节Wnt/β-catenin信号通路抑制HCC进展（1）FISH结果显示lncRNA620512既位于细胞核内也位于细胞质中,主要位于细胞质中,我们猜测lncRNA620512可能通过内源竞争RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）机制对HCC进行调控;（2）应用数据库Lnc Base、mirdb和mir Path,我们预测miR-6856-5p和ZNF671为lncRNA620512下游靶基因;（3）qRT-PCR结果显示miR-6856-5p在HCC细胞系中的表达高于在健康肝细胞系中的表达;当过表达lncRNA620512时,miR-6856-5p的表达降低;（4）双荧光素酶实验结果显示,在lncRNA620512-WT中荧光素酶的活性被miR-6856-5p抑制,远低于lncRNA620512-MUT,因此,我们认为lncRNA620512与miR-6856-5p存在直接结合;（5）qRT-PCR结果显示ZNF671在HCC细胞系中的表达低于在健康肝细胞系中的表达;当过表达miR-6856-5p时,ZNF671的表达降低;（6）双荧光素酶实验中,我们发现miR-6856-5p对ZNF671-WT里的荧光素酶有明显的抑制作用,但在ZNF671-MUT存在下,miR-6856-5p对于荧光素酶活性无抑制,因此,我们认为miR-6856-5p与ZNF671存在直接结合。（7）Western Blot结果显示ZNF671与miR-6856-5p负相关,同时,Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin、c-Myc、cyclin D1与miR-6856-5p正相关;（8）挽救实验结果显示,过表达lncRNA620512导致HCC细胞中ZNF671表达量升高,而当同时过表达miR-6856-5p时,ZNF671的增加趋势被部分逆转,CCK-8细胞增殖实验及Transwell实验结果表明过表达miR-6856-5p能够部分逆转lncRNA620512抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭的作用;（9）对裸鼠皮下肿瘤进行免疫组化,结果显示过表达lncRNA620512时,ZNF671表达增多。结论:1.lncRNA620512在HCC患者TACE治疗后血清中表达量升高,在HCC细胞系中低表达,可能是HCC的抑癌基因。2.lncRNA620512抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长。3.lncRNA620512通过内源性竞争miR-6856-5p调控ZNF671,进而调节Wnt/β-catenin信号通路抑制HCC进展。