背景:新生血管是许多致盲性眼病的病理基础,它源于现有的血管系统,在缺血、缺氧的环境下被刺激生长,眼底新生血管的形成不遵循正常的血管方向,它会侵入玻璃体腔,最终导致玻璃体出血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼。大量研究证实血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是促进视网膜血管生成的主要因素,因此玻璃体腔注射抗VEGF药物已成为针对眼底新生血管的临床一线治疗方法。然而,为了达到预期的治疗效果,通常需要进行多次眼内注药,这不仅会增加患者的就诊频率和感染风险,还会引起患者对药物的抵抗性和耐药性。目的:本研究的目的是研发一种以玻璃体腔注射为治疗手段、能够安全、有效抑制VEGF的新型基因药物。该药物能够局部敲除眼内的VEGFA基因,抑制VEGF表达并阻止视网膜新生血管形成,为治疗视网膜新生血管性疾病提供一个新的思路。方法:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术设计2条能够靶向敲除人兔VEGFA基因的CRISPR序列,并构建载有该序列的大肠杆菌质粒,采用脂质体Lipofectamine 3000作为药物载体将质粒转染至人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）,提取转染后细胞基因组DNA并进行PCR扩增,对扩增产物进行DNAⅠ代测序,筛选出能够明显敲除VEGFA基因的CRISPR序列。然后用一种新型高分子聚合物P[TA-（PEG+PEI）]（PTEE）作为药物载体,包裹筛选出的有效质粒,通过琼脂糖凝胶电泳和电位分析探索材料与质粒的最佳配比,实现PTEE loading anti-VEGFA plasmid（PLAP）的合成与验证,制备出稳定的新型基因药物PLAP。以ARPE-19细胞为实验对象,将不同浓度的药物载体PTEE与ARPE-19细胞共孵育24和48小时,利用CCK-8（Cell counting kit-8,CCK-8）试验评估PTEE的生物相容性;根据筛选出的CRISPR序列,构建连有GFP蛋白和目的基因的大肠杆菌质粒,分别采用脂质体Lipofectamine 3000、jet OPTIMUS（?）DNA体外转染试剂、PTEE纳米材料作为载体,在293T细胞、ARPE-19细胞和Müller细胞中进行转染,通过光学显微镜观察、流式细胞检测GFP蛋白的表达情况,以此来评价每种药物在不同细胞中的转染效率。随后,建立ARPE-19细胞低氧模型,将PLAP新型基因药物转染至细胞内,利用酶联免疫吸附测定技术（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定实验组和对照组VEGFA的表达量,以评估新型基因药物的有效性。将新型基因药物PLAP注射入兔眼玻璃体腔,通过眼底照相和频域光学相干断层扫描（optical coherence tomography,OCT）记录兔眼眼底情况,采用病理切片观察实验动物视网膜和重要脏器的形态及炎性细胞浸润情况,以评估药物安全性。构建兔眼视网膜新生血管模型,经药物治疗后定期观察眼底情况,测量每组动物在治疗10周后房水中VEGFA表达量,观察结束后摘除眼球进行视网膜铺片和病理切片,以此来验证新型基因药物PLAP抑制视网膜新生血管的有效性。结果:ARPE-19细胞与浓度为0.25μg/μl、0.5μg/μl、0.75μg/μl、1.0μg/μl、1.25μg/μl、1.5μg/μl的PTEE材料共孵育24小时后细胞活力未受到影响;新型载基因药物PLAP在293T细胞、ARPE-19细胞和Müller细胞中的转染效率均高于以脂质体Lipofectamine 3000和jet OPTIMUS（?）DNA体外转染试剂作为基因载体的药物,且能够更有效地抑制VEGFA的表达,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。新型载基因药物PLAP注入兔眼玻璃体腔后未引起明显的炎症反应,与对照组相比,注药后第2周已能够观察到清晰的眼底;在兔眼视网膜新生血管模型中,PLAP抑制视网膜新生血管的作用强于对照组,药物有效作用时间达12周以上;经PLAP药物治疗后,兔眼房水中VEGFA的表达量低于对照组且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:PLAP是一种玻璃体腔注射用的、能够安全、有效抑制VEGF的新型基因药物,可局部敲除兔眼内的VEGFA基因,有效抑制兔眼视网膜新生血管的形成,有待用于治疗视网膜新生血管性疾病。