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目的 观察苦参碱(matrine,MA)对视网膜母细胞瘤株HXO-Rb44细胞的作用,探讨其抑制增殖和促进凋亡可能的机制,以期为临床综合治疗视网膜母细胞瘤提供一个可行的方法。
方法 采用MTT法检测MA对HXO-Rb44细胞增殖的影响,检测不同浓度MA对HXO-Rb44细胞的增殖抑制情况,为下一步实验筛选适宜的MA药物浓度;采用流式细胞仪检测MA对HXO-Rb44细胞S期细胞百分比的影响;采用常规HE染色光镜观察、TUNEL法和AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测MA作用HXO-Rb44细胞后,细胞凋亡的形态学和定量方面的改变:采用端粒重复扩增(telomericrepeatamplificationprotocol,TRAP)法检测HXO-Rb44细胞表达端粒酶活性的变化;并通过细胞免疫组织化学染色结合计算机自动图像分析技术,观察分析MA对HXO-Rb44细胞内增殖和凋亡的三个主要靶基因,PCNA、bcl-2、bax的调控,初步探讨其抑制HXO-Rb44细胞增殖、诱导其凋亡的分子机制。
结果 0.1~3.2mmol/L浓度的MA对HXO-Rb44细胞具有不同程度的抑制作用(P<0.01),24小时内呈浓度依赖性。选取0.4mmol/L浓度的MA作为以后的实验药物浓度。MA作用HXO-Rb44细胞12小时后,S期细胞百分比下降,48小时下降为26.98%;MA作用12小时后,HXO-Rb44细胞的端粒酶活性也出现下降(P<0.01),48小时端粒酶相对活性为33.13%;MA作用后,Rb细胞S期细胞百分比和端粒酶活性均呈时间依赖性下降,两者之间具有一定相关性(r=0.954,双侧Pearson检验P=0.000<0.001)。MA作用HXO-Rb44细胞12小时后,开始诱导HXO-Rb44细胞凋亡,细胞凋亡率增加(P<0.01),随着作用时间延长,凋亡细胞明显增多;细胞的端粒酶活性逐渐下降,48小时下降最著,细胞凋亡率和端粒酶活性两者的变化在48小时内均呈时间依赖性,并具有一定相关性(r=-0.96l,P<0.001)。此外,MA作用HXO-Rb44细胞后,细胞内的PCNA蛋白表达水平下降,bcl-2/bax蛋白表达量的比例减小,与未用药组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。
结论 MA可以抑制HXO-Rb44细胞增殖,诱导其凋亡,细胞内的PCNA蛋白表达水平下降,bcl-2/bax蛋白表达比例减小,端粒酶活性下降可能是MA作用相关机制,提示MA对视网膜母细胞瘤的综合治疗具有一定的应用前景。