论文部分内容阅读
前列腺癌（prostate cancer,PCa）目前是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy,ADT）是进展期PCa经典的治疗方案,然而PCa患者接受ADT治疗12-18个月后,大部分患者都会对ADT治疗产生抵抗,进展为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）,CRPC 患者预后极差,是PCa治疗过程中面临的重大挑战。雄激素受体（androgen receptor,AR）信号通路的重新激活是CRPC进展的重要机制,除此之外,AR非依赖性信号通路,如糖皮质激素受体异常激活、免疫介导的治疗抵抗及神经内分泌分化等也会促进CRPC进展。因此,阐明CRPC的发生发展机制并筛选出新的治疗靶点对晚期PCa患者的临床治疗具有重要的意义。线粒体是细胞生物能量和物质合成的细胞器,可协调细胞对外界刺激的适应,例如营养剥夺、氧化应激、DNA损伤和内质网应激等。近年来,已有研究证实癌细胞中的代谢重编程在机制上与致癌信号密切相关,线粒体靶向治疗作为潜在的肿瘤治疗策略引起了广泛关注。研究发现,线粒体在PCa进展中发挥着重要作用,在PCa进展过程中线粒体氧化磷酸化被重新激活,并且富含线粒体的细胞表型与PCa进展及患者不良预后密切相关。此外,在PCa中AR信号通路、线粒体形态和代谢重编程之间存在一定的分子联系;雄激素剥夺可以引起线粒体膜破坏;线粒体代谢或结构一旦受损则可以诱导线粒体Ca2+超载或氧化应激从而引起CRPC细胞死亡。这些发现表明,增强的线粒体活性,特别是在雄激素剥夺条件下,可能会导致ADT治疗失败以及CRPC发生及进展。PPFIA4也称liprin α4,是liprin α家族蛋白成员,已在多种蛋白复合物中被发现。已有研究发现PPFIA4是难治性胰腺癌、小细胞肺癌和肾透明细胞癌的潜在治疗靶点,并且可能与细胞异常代谢过程相关。我们课题组长期致力于CRPC驱动基因筛选及机制探索,已经发现TXNDC5、PADI2等多个基因在CRPC发生及进展中的重要作用。在本研究中,我们发现PPFIA4在PCa细胞雄激素剥夺条件下及CRPC组织中表达上调。综上,我们推测PPFIA4可能在CRPC发生及进展中发挥重要作用,并进一步深入探讨了 PPFIA4在CRPC发生及进展中的分子机制。第一部分PPFIA4通过增强线粒体功能促进CRPC发生及进展CRPC进展与ADT治疗密切相关,探究ADT治疗过程中异常变化的基因并探索其作用机制有利于我们更好地认识CRPC的发生及进展,从而研发出新的治疗策略。线粒体是能量产生及物质合成的关键细胞器,有利于肿瘤细胞适应不断改变的细胞微环境,并促进其存活、增殖和转移。PPFIA4已被证实能够促进多种肿瘤的发生发展,但其在PCa中的研究尚未见报道,本研究通过选取CRPC公共数据库进行差异表达基因筛选,识别出CRPC进展过程中的关键基因PPFIA4,并将PPFIA4分子与线粒体功能相联系,在多层面阐述了其在CRPC进展中的作用,结果如下:1.PPFIA4在CRPC中高表达,并与患者不良预后密切相关为了筛选促进CRPC进展的关键基因,我们使用CRPC相关的公共数据集进行了基因差异表达分析,筛选出在CRPC临床样本中表达上调和在雄激素敏感的LNCaP细胞中长期雄激素剥夺培养后表达上调的基因亚群,发现其中共有的4个表达上调基因SMC4、CKS2、LPL和PPFIA4。通过RT-qPCR实验验证我们发现,在LNCaP细胞雄激素剥夺培养过程中PPFIA4表达上调最明显。然后通过其它公共数据集和我们收集到的临床病例样本进一步分析验证发现,与局限性PCa相比,PPFIA4在CRPC中表达较高,并且其高表达与患者不良预后密切相关,提示PPFIA4可能参与CRPC的发生及进展。2.PPFIA4具有雄激素反应性在雄激素敏感的LNCaP细胞中,使用雄激素类似物R1881可以抑制PPFIA4在mRNA及蛋白水平上的表达,而雄激素剥夺可以促进PPFIA4的表达。这与AR及AR下游靶基因PSA的表达变化相反,R1881可以促进AR及PSA的表达,而雄激素剥夺可以抑制AR及PSA的表达。3.PPFIA4是AR抑制性基因TCGA及GEO公共数据库分析结果也显示,在mRNA水平上PPFIA4与PSA的表达呈负相关。为了进一步探究PPFIA4的表达是否受AR转录调控,我们通过ChIP以及双荧光素酶报告实验证实,AR可以富集到PPFIA4的启动子区并且抑制性转录调控PPFIA4的表达。但是,PPFIA4却对AR和AR下游靶基因的表达无明显调控作用。4.PPFIA4过表达使PCa细胞具有CRPC表型特点我们发现使用小干扰RNA沉默PPFIA4可以有效抑制C4-2B、PC3细胞增殖,促进细胞凋亡,而过表达PPFIA4可以减少雄激素剥夺引起的LNCaP细胞生长抑制和细胞凋亡,并促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。为进一步验证PPFIA4在CRPC进展中的作用,我们采用裸鼠皮下成瘤模型,结果显示,过表达PPFIA4可以促进去势小鼠皮下肿瘤的生长,而敲减PPFIA4可以抑制去势小鼠皮下肿瘤的生长。5.部分PPFIA4蛋白定位于线粒体我们在沉默PPFIA4的C4-2B细胞中行RNA-seq分析,发现差异表达基因主要富集于代谢通路。通过免疫共沉淀实验和蛋白质谱分析,我们发现大部分PPFIA4的互作蛋白定位于线粒体。Western blot和细胞免疫荧光实验结果进一步证实,PPFIA4除了存在于胞浆,还有一部定位于线粒体。6.PPFIA4可以增强线粒体功能我们首先检测了雄激素剥夺与线粒体功能的关系,结果显示,与常规培养的LNCaP细胞相比,在雄激素剥夺培养条件下线粒体形态变得更加不规则。然后通过GSEA分析LNCaP细胞雄激素剥夺培养前后的基因表达谱芯片结果,我们发现线粒体功能相关基因与雄激素剥夺呈负相关关系,提示雄激素剥夺可以抑制线粒体功能。另外,我们通过检测细胞线粒体耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）、线粒体膜电位、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平、NADPH/NADP+比值评估 PPFIA4对线粒体功能的影响。结果显示,在LNCaP细胞中过表达PPFIA4可以逆转雄激素剥夺或者雄激素剥夺条件下抗雄药物恩杂鲁胺刺激导致的线粒体OCR的下降,而在C4-2B细胞中沉默PPFIA4则会加剧恩杂鲁胺刺激导致的线粒体OCR下降。同时,粒体膜电位、ROS水平、NADPH/NADP+比值结果显示,过表达PPFIA4可以增强雄激素剥夺条件下线粒体活性,而沉默PPFIA4则会降低线粒体活性。综上所述,PPFIA4在CRPC中表达升高并且其高表达与患者不良预后密切相关,其表达还具有雄激素抑制性的特点,受AR转录抑制调控。部分定位于线粒体的PPFIA4蛋白通过保护并增强雄激素剥夺条件下线粒体功能促进CRPC发生发展。第二部分PPFIA4通过Src促进MTHFD2的酪氨酸磷酸化并增强线粒体功能为了进一步探究PPFIA4如何影响线粒体功能,本研究采用免疫共沉淀实验联合蛋白质谱分析,系统筛选了 PPFIA4的互作蛋白,进一步阐明了 PPFIA4对线粒体功能影响的作用机制,并获得以下结果:1.MTHFD2是PPFIA4重要的互作蛋白研究已发现上调的线粒体一碳代谢水平与PCa进展密切相关,线粒体一碳代谢关键酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2）在PCa进展中发挥重要作用,并且可以影响线粒体功能。在本研究中,我们通过免疫共沉淀联合蛋白质谱分析对PPFIA4互作蛋白进行了系统筛选,鉴定出MTHFD2是PPFIA4重要的潜在互作蛋白。细胞免疫荧光和免疫共沉淀实验结果进一步证实二者存在结合,并且PPFIA4-MTHFD2复合物主要存在于线粒体。2.PPFIA4通过MTHFD2影响线粒体功能我们通过检测线粒体OCR、ROS水平及NADPH/NADP+比值反映线粒体功能,结果显示,沉默MTHFD2可以降低PPFIA4过表达引起的线粒体功能增加,提示PPFIA4可以通过MTHFD2影响线粒体功能。3.PPFIA4影响MTHFD2的酪氨酸磷酸化水平Westen blot和qRT-PCR实验结果显示,PPFIA4对MTHFD2的表达无明显调控作用,提示PPFIA4可能通过蛋白翻译后修饰途径调控MTHFD2。免疫沉淀实验结果显示,过表达PPFIA4可以上调MTHFD2的酪氨酸磷酸化水平,而沉默PPFIA4可以降低MTHFD2的酪氨酸磷酸化水平。4.PPFIA4通过Src促进MTHFD2的酪氨酸磷酸化我们的结果显示,Src激酶可以在线粒体中与MTHFD2结合,应用Src特异性抑制剂或小干扰RNA抑制或沉默Src可以降低MTHFD2酪氨酸磷酸化水平。同时,过表达PPFIA4可以促进Src与MTHFD2之间的结合,而沉默PPFIA4可以抑制二者的结合,从而影响Src对MTHFD2酪氨酸磷酸化的调控,并且抑制或沉默Src可以降低过表达PPFIA4引起的MTHFD2酪氨酸磷酸化水平升高。5.MTHFD2抑制剂可有效延缓CRPC进展细胞增殖以及细胞凋亡实验结果显示,在过表达PPFIA4的LNCaP细胞中,MTHFD2抑制剂DS18561882可有效抑制细胞增殖,增加细胞凋亡率。而在C4-2B细胞中,沉默PPFIA4同时给与DS18561882刺激则可协同抑制细胞增殖,增加细胞凋亡率。DS18561882与恩杂鲁胺联合使用可更加有效地协同抑制细胞增殖并诱导强烈的细胞凋亡反应。同时,裸鼠皮下成瘤实验结果显示,DS18561882可以明显抑制PPFIA4过表达引起的去势小鼠皮下肿瘤的生长,并且与恩杂鲁胺单一治疗相比,DS18561882和恩杂鲁胺联合使用对抑制去势小鼠皮下肿瘤生长的效应更加明显。综上所述,PPFIA4可在线粒体与MTHFD2结合,通过Src介导的磷酸化途径调控MTHFD2的酪氨酸磷酸化水平,从而保护并增强线粒体功能促进CRPC发生及进展。MTHFD2抑制剂可有效抑制PPFIA4过表达引起的细胞增殖和肿瘤生长,并且和恩杂鲁胺联合应用时可更加有效地延缓CRPC进展。