在全世界范围内,恶性肿瘤发病率和死亡率不断攀升。与此同时,乳腺癌是一类复杂的疾病,主要表现为肿瘤间和肿瘤内异质性较大且分型较多的特点。缺氧状态的肿瘤微环境以及长链非编码RNA在肿瘤代谢、增殖和侵袭的过程中起到极为重要的作用。与其他类型乳腺癌相比,三阴性乳腺癌由于其独特的分子表型特征,其治疗手段有限,且呈现易复发转移,预后较差的特征。缺氧条件下,探究长链非编码RNA表达水平与相关因素及其在三阴性乳腺癌中的发生发展机制,可以在三阴性乳腺癌精准治疗中发挥巨大作用。第一部分:lncRNA GHET1通过Hippo/YAP信号途径促进低氧环境下诱导的三阴性乳腺癌的糖酵解、增殖与侵袭机制目的:在威胁全球女性健康的恶性肿瘤中,乳腺癌位居前列。在不同类型的乳腺癌中,3种基因均为阴性被称为三阴性乳腺癌。具有增殖速度快、分子分型多、治疗方法少和治疗效果差等特点。在乳腺癌的发生发展过程中,lncRNA和缺氧微环境扮演重要角色。因此本研究针对三阴性乳腺癌在低氧诱导条件下筛选特定lncRNA以及该特定lncRNA对三阴性乳腺癌患者的相关机制进行探究,为寻找三阴性乳腺癌诊疗新靶点奠定基础。实验材料与方法:●本研究收集2017年1月至2019年6月期间在我院接受诊治的三阴性乳腺癌患者的肿瘤组织样本（TNBC组）和相邻的组织学正常的组织（normal组）,所有乳腺癌患者的肿瘤组织样本术后经过免疫组化检测后结果均提示人表皮生长因子受体2（HER-2）、孕激素受体（PR）、雌激素受体（ER）均为阴性;●本研究采用人正常乳腺细胞（MCF10A）,三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,MDA-MB-468,HCC1937 和 BT-549 等 4 种细胞系,并根据实验室操作规范对细胞系进行复苏、传代和冻存;●本研究采用TRizol法提取TNBC组与normal组临床样本、各细胞和组织处理组的总RNA,并根据PCR方法进行逆转录和扩增;●依据EdU染色试剂盒说明书,对接种于24孔板中的细胞系进行染色和封片,每个视野内阳性细胞数利用荧光显微镜进行记录,对EdU标记率进行计算;●将处理后的细胞系消化后吹打均匀,重悬细胞,接种于6孔板,最后进行固定、漂洗和0.1%结晶紫溶液染色并观察;●将细胞接种到Transwell小室,培养、固定、漂洗和染色,最后进行观察统计;●在Normoxia或Hypoxia条件下培养的细胞系,对培养基中乳酸和葡萄糖含量进行测定;●按照标准实验步骤提取蛋白质、检测蛋白质浓度,并进行包括蛋白质变性、电泳、转印、染色和显色等Western blot实验步骤;●选取12只4至6周龄的BALB/c雄性裸小鼠为研究对象,随机分为4组,将细胞系通过皮下注射到裸鼠右侧腋窝,测量肿瘤大小和处死后称量肿瘤重量;●独立样本t检验和单因素方差分析采用SPSS 25.0进行统计分析。结果:●lncRNA GHET1在TNBC组的表达水平明显升高,乳腺癌细胞系中lncRNAGHET1的表达水平在低氧环境下明显升高,且随着低氧环境干预时间的延长,lncRNAGHET1的表达水平也随着升高;●在低氧环境下,TNBC组糖酵解水平和细胞的增殖、复制和侵袭能力在下调lncRNAGHET1的表达水平后被抑制。●干扰lncRNA GHET1的表达可抑制低氧环境下三阴性乳腺癌细胞Hippo/YAP通路中相关蛋白的激活表达水平及YAP核移位能力;●lncRNA GHET1高表达可促进三阴性乳腺癌肿瘤在裸鼠体内的重量和体积的生长;●lncRNA GHET1高表达在体内可促进三阴性乳腺癌的Hippo/YAP通路,且促进YAP的核移位。结论:低氧环境下可诱导lncRNAGHET1表达导致Hippo/YAP信号通路过度激活,提高TNBC细胞的细胞增殖、细胞活力和侵袭能力并且能提高葡萄糖消耗和乳酸产生水平;同时可能促进TNBC肿瘤组织的生长速度。第二部分:lncRNAGHET1表达与相关影响因素的研究目的:本课题的前期基础研究结果显示,TNBC组织或者细胞中lncRNA GHET1的表达水平显著升高。类似的研究显示,lncRNAGHET1在肺癌标本中的表达明显升高与肿瘤大小、标本淋巴结转移和肿瘤细胞分化程度相关。同时,lncRNA GHET1高表达在肺癌以及宫颈癌患者提示其预后较差。因此,本研究在TNBC患者中lncRNAGHET1表达情况分析的基础上进行分组和随访,探究lncRNA GHET1表达情况的影响因素以及lncRNA GHET1表达对患者预后的影响。为三阴性乳腺癌的精准治疗和科学随访奠定基础。材料与方法●本研究收集2017年1月至2019年6月期间在锦州医科大学附属第一医院接受诊治的三阴性乳腺癌患者,收集所有纳入研究患者的肿瘤组织样本;●收集研究对象患者的人口学、临床病史和生化指标;●收集研究对象患者的手术和病理相关指标;●根据lncRNA GHET1在三阴性乳腺癌患者肿瘤组织中的表达水平以lncRNA GHET1表达水平的均值作为区分的值;纳入低表达组的是GHET1表达水平低于均值的患者,纳入高表达组的是GHET1表达水平高于均值的患者,共分为2组;●随访时间自患者术后开始至术后满2年,随访的方式为门诊就诊、电话随访以及微信访谈;●独立样本t检验、卡方检验（理论数值和实际数值＜5时,即采用Fisher精确概率法）采用SPSS 25.0进行统计分析,以p＜0.05作为差异有统计学意义。结果:●TNBC组患者组织lncRNAGHET1表达水平和年龄、BMI、疾病史和血脂等指标无明显相关性;●TNBC组患者组织lncRNA GHET1表达水平和手术方式、是否存在瘤栓和术后的放化疗治疗方式等因素无明显相关性,但受到肿瘤的远端转移、淋巴转移及向周围组织浸润和肿瘤的分期等转移、侵袭因素的影响;●TNBC组患者组织lncRNA GHET1表达水平和患者外周血CD8+T细胞比例和T细胞数量的影响,但其不仅受到外周血的CD4+T细胞比例的影响,还受到CD4+/CD8+比值的影响;●lncRNAGHET1高表达缩短患者生存时间、降低无病生存率且提高复发比例。结论:lncRNAGHET1高表达与TNBC患者的肿瘤的分期、远端转移、淋巴转移以及浸润密切相关,并且lncRNAGHET1表达水平越高,TNBC患者生存时间更短、无病生存率（DNF）更低且复发比例更高,推测lncRNA GHET1可能调节CD4+/CD8+比值和CD4+T细胞,进而影响TNBC患者的免疫功能,从而影响患者的预后情况。