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迄今为止发现数量尚极其有限的古生菌病毒群体却已展现了极为丰富的多样性,对它们的研究正使人们对病毒的起源、分类和对生命进化的影响形成新的认识。相对于6200多株原核病毒,目前仅有约120株古生菌病毒被报道。由于缺乏稳定、易操作的病毒-宿主间遗传操作系统,仅有少数几株嗜盐古生菌病毒得到深入研究,对于古菌病毒在感染宿主、基因组复制、病毒组装及释放等生命循环过程中调控机制的认识大多还是通过对病毒基因组的生物信息学分析获得的。以更多古生菌病毒为材料,深入研究其分子生物学机理,构建病毒及其宿主的遗传操作系统,对于进一步揭示古生菌病毒的生物学特性无疑具有重要意义。在本研究中,以极端嗜盐古生菌Natrinema sp. J7携带的、以质粒形式存在的温和病毒SNJ1为研究对象,确定了其基因组上与病毒/质粒复制、质粒稳定分配及拷贝数调控密切相关的基因及区域,构建了E.coli- Natrinema sp. J7穿梭载体；并基于所构建的SNJ1遗传工具,确定了SNJ1超感染免疫建立的关键蛋白,预测了超感染免疫建立的模型和SNJ1的溶原裂解开关。Natrinema sp. J7是本实验室从湖北应城盐矿分离得到的一株嗜盐古生菌。其实验室衍生菌株根据含有质粒的不同分别命名为J7-1及CJ7。J7-1含有以质粒形式存在的SNJ1原病毒基因组pHH205, CJ7不含有任何质粒,可以被SNJ1侵染形成噬菌斑。根据SNJ1的大小衣壳蛋白的排布和保守性及其含有的ATPase将其归为Sphaerolipoviridae科。至今为止,对于SNJ1的研究仅局限在揭示病毒的生物学特性上,并没有对病毒的复制机制及复制循环过程中的调控机制进行研究。此外,自SNJ1的宿主J7分离以来并未构建成熟的遗传操作系统,这在很大程度上限制了对于J7及其病毒的研究。在本研究中,通过构建一系列含有SNJ1不同复制区域的E. coli-Natrinema sp穿梭载体,确定了大小为3.9kb的SNJ1的最小复制区域。其含有七个预测的ORF （ORF5到ORF11-12）,组成了两个操纵子（ORF5到ORF6,ORF7到ORF11-12）。其中,只有ORF11-12的基因产物对于SNJ1复制是必须的,将其命名为repA。Western blot结果显示,SNJ1走裂解循环道路时RepA的表达量逐渐上升。生物信息学分析结果显示RepA与HUH endonuc leases超家族的滚环复制相关的复制起始蛋白有较低的同源性,其含有这类蛋白保守的三个基序,推测RepA很可能介导了SNJ1基因组的滚环复制。除了RepA,位于最小复制区两端的基因间隔区域575-861和3881-4481对于SNJl的复制也是必需的。SNJ1原病毒基因组pHH205及各穿梭载体的拷贝数相对于J7染色体而言为1到3个。当将ORF4的ATG进行突变后,穿梭载体的拷贝数会增加到30左右,说明ORF4的基因产物gp4是SNJ1病毒基因组拷贝数的负调控因子。此外,gp4的缺失会严重影响无抗条件下SNJ1原病毒基因组在J7中的稳定性。除gp4外,294-401及4481-6482区域也在一定程度上影n响了载体的稳定分配。基于SNJ1的稳定复制区1-4481区域构建了首个E. coli-Natrinema sp穿梭表达载体pYJ-HH。该载体大小9.9kb,含有多克隆位点区域、组氨酸标签及Haloferax volcanii DS52hsp70启动子。利用pYJ-HH首次在J7中实现了Haloarcula hispanica 33960 amyH基因的稳定表达及amylase蛋白的纯化。此外,pYJ-HH在Natrinema sp. JCM8980中也具有复制功能,暗示着pYJ-HH有可能被广泛的应用到Natrinema属的遗传操作中。如前所述,SNJ1可以侵染不含SNJ1原病毒基因组的CJ7菌株形成噬菌斑,但是不能侵染含有SNJ1原病毒基因组的J7-1菌株,说明溶原化的SNJ1病毒在J7-1中建立了超感染免疫,阻止了SNJ1的再次侵染。为了确定SNJ1基因组上负责控制超感染免疫的区段,将构建的含有SNJ1不同复制区域的穿梭载体转化进CJ7菌株。结果发现,携带pYCJ载体的CJ7可以抵抗SNJ1的侵染,说明SNJ1免疫性建立的关键区域位于1-4481片段上。由于在J7中缺少对SNJ1复制区域进行研究的遗传操作体系,因此基于J7染色体复制区域构建了可以在J7中稳定复制的穿梭载体pFJ6。pFJ-6穿梭载体大小为5.7 kb,相对于J7染色体的拷贝数为1,在无抗条件下可以稳定地随着J7的复制分配到子细胞中且实验过程中并未检测到它与宿主染色体间的重组事件。利用pFJ-6穿梭载体对1-4481区域进行了分段表达,发现携带pFJ6-1-656的CJ7菌株不能被SNJ1感染。对于1-656区域进行进一步的缩短及突变,确定ORF4的基因产物gp4是控制SNJ1超感染免疫建立的关键因子。用相同剂量的SNJ1分别感染CJ7菌株,及携带pFJ6-1-656穿梭载体的CJ7菌株,10小时后,几乎全部的CJ7细胞中检测到了SNJ1病毒基因组,而只有10%的携带pFJ6-1-656穿梭载体的CJ7菌株中被检测到。说明,SNJ1的超感染免疫的建立有可能是由于在gp4的调控下,阻止了后续侵染的SNJ1病毒的基因组的注入,或影响了病毒基因组的稳定复制及分配。生物信息学分析结果显示,gp4含有细菌及古生菌转录调控因子中保守的AbrB-like Swapped-Hairpin结构域,说明其很可能是SNJ1的转录调控因子。此外,本研究证实,gp4同时介导了SNJ1病毒基因组的稳定分配、原病毒基因组低拷贝的维持及溶原化的SNJ1病毒的超感染免疫的建立三个过程。因此,gp4很可能作为SNJ1的全局调控因子通过调控多个相关基因的转录来操控SNJ1溶原、裂解状态的转变。对于嗜盐古生菌温和病毒SNJ1复制区域的鉴定及复制区内基因功能的研究使我们加深了对嗜盐古生菌温和病毒在复制循环过程中基因组的复制、拷贝数的调控、基因组的稳定分配及溶原、裂解状态的转变等关键过程的认识。基于SNJ1复制区域及染色体复制区域所构建的J7及其病毒的遗传操作体系对于进一步研究Natrinema属的菌株及其病毒奠定了坚实的基础。SNJ1超感染免疫的相关研究,加深了极端环境下病毒与宿主间的相互作用关系的认识,弥补了古生菌病毒超感染免疫研究的缺乏。本研究中鉴定得到了许多SNJ1复制循环过程中的调控基因及区域,对于这些关键基因及区域的进一步研究将有助于我们更加深入的了解极端环境下病毒的生存策略,揭示病毒与宿主的进化关系。