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微藻生物柴油因环保、可再生、原料生长周期短等优点成为研究的热点。利用基因工程手段调控油脂代谢相关基因的表达是提高微藻油脂积累量的重要途径。Dof型转录因子是植物所特有的一类转录因子,因其具有一个单锌指的保守序列,而被称为Dof(DNA binding with one finger)。在高等植物中,Dof蛋白通过调节碳氮代谢关键基因的方式调控碳氮代谢通路,过表达Dof-type型转录因子可以提高油脂含量。本研究通过遗传重组的方法分别将大豆(Glycine max)Dof-type型转录因子基因(gdof)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Dof-type型转录因子基因(crdof)转入莱茵衣藻CC849中,构建了受热激诱导的基因工程藻,实现Dof基因的可控表达。工程藻诱导后Dof基因的表达量显著增加,胞内油脂积累量明显提高。在此基础上,本研究进一步探索了Dof基因与11个油脂代谢相关基因的相互关系,证实Dof基因通过影响油脂代谢相关基因的方式增加了油脂积累量。具体研究结果如下:1.一方面根据莱茵衣藻密码子偏好性改造大豆Dof11基因,获得了长度为960bp的优化基因c-gdof。另一方面,在莱茵衣藻中进行生物信息学预测并首次克隆其自身Dof的c DNA,其长度为1875bp,并命名为c-crdof(如附录中所示)。然后分别构建了c-gdof和c-crdof的过表达载体,并转入莱茵衣藻。通过BODIPY染色筛选和定量PCR筛选最终获得了高效表达Dof基因的转基因藻株Tranc-crdof-12和Tranc-gdof-60。通过荧光定量PCR技术对转基因藻中c-crdof和c-gdof基因表达量检测分析发现:热激诱导后,c-crdof和c-gdof的表达量显著上升,转基因藻Tranc-crdof-12中c-crdof基因表达量比CC849热激处理前最高增加了3.51倍,转基因藻Tranc-gdof-60中c-gdof基因表达量比热激处理前最高增加了4.12倍。2.为更进一步探索过表达Dof-type型转录因子提高油脂含量的作用方式,本研究对转基因藻中与油脂代谢相关的11个酶(BCC1,BCC2,ACP1,SQD1,SQD2,MGD1,DGD1,FAT1,CIS1,ACS1,PGP1)基因表达量进行分析,其中变化较大的为:转化子Tranc-crdof-12中BCC1的表达量较野生型升高了3.42倍,FAT1的表达量较野生型升高了5.72倍,SQD1较野生型升高了2.10倍,DGD1的表达量较野生型升高了7.1倍,MGD1较野生型升高了2.11倍,PGP1较野生型升高了2.40倍,ACS1的表达量较野生型降低了1.5倍,CIS2较野生型降低了0.92倍;转化子Tranc-gdof-60中FAT1的表达量较野生型升高了4.21倍,ACS1的表达量较野生型降低了1.0倍,DGD1的表达量较野生型升高了1.80倍,PGP1较野生型升高了3.85倍。上述结果表明:c-crdof与c-gdof基因可能是通过影响油脂代谢相关基因表达量的方式改变了胞内油脂含量。3.用GC-MS对转基因藻和野生藻CC849的总脂肪酸含量及组分进行检测,结果如下:与野生藻相比,在一次热激诱导的条件下,转基因藻Tranc-crdof-12与Tranc-gdof-60的脂肪酸含量分别增加了23.24%,27.79%;在多次热激诱导的条件下,转基因藻Tranc-crdof-12与Tranc-gdof-60的脂肪酸含量分别提高了51.85%,69.89%。其中组分提高量较高的为C16:0、C16:1、C18:1t、C18:3n6。上述结果表明:目的基因c-crdof与c-gdof被诱导表达后促使莱茵衣藻的胞内油脂含量显著上升。综上所述,本实验通过基因工程的手段使gdof基因与crdof基因在莱茵衣藻过表达,并最终提高了细胞的油脂含量,合理改造了微藻类的代谢途径,为提高生物产油产量的研究打下基础,同时可以更好的理解其他代谢途径对藻类油脂代谢影响,并对转录因子调控藻类油脂代谢及其他代谢通路的研究奠定一定基础。