在昆虫和蜘蛛神经系统中,胆碱能通路是最重要的兴奋性神经传递系统之一。乙酰胆碱(ACh)是一种重要的神经递质,由广泛分布于整个神经系统类胆碱能神经元合成,并在昆虫突触神经信号传导中起关键作用。目前研究发现,在节肢动物体内具有两种乙酰胆碱受体:毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic ACh receptors,mAChRs)和烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic ACh receptors,nAChRs)。尤其是烟碱型乙酰胆碱受体,其作为新烟碱类杀虫剂的靶标被广泛研究,新烟碱类杀虫剂与受体中特定的氨基酸进行结合。根据每种活性化合物的分子特性和参与亚基不同的类型,这些残基也是有所不同的。新烟碱类杀虫剂的大量施用带来很多不良影响,例如农药残留超标、昆虫抗药性的产生、对天敌的毒性和对经济昆虫的副作用等。此外,研究表明昆虫与天敌生物间杀虫剂靶标、解毒代谢酶的差异是导致农药毒性选择的重要原因。新烟碱类杀虫剂对水稻害虫显示出较高的毒力,但对天敌拟环纹豹蛛毒力较低,这种农业害虫与天敌之间的毒力差异机制值得深入研究。本文通过拟环纹豹蛛转录组测序,获取了丰富烟碱型乙酰胆碱受体的基因信息,为研究新烟碱类杀虫剂选择性和抗药性机制提供了重要基础。同时也对农业模式害虫东亚飞蝗进行烟碱型乙酰胆碱受体基因的分析,探寻杀虫剂对天敌-害虫选择性机理。一、东亚飞蝗nAChRs亚基不同选择性剪接对Ach的反应的影响因为昆虫中枢神经系统(CNS)乙酰胆碱受体的丰富性和发挥着重要作用,这使得其成为一些杀虫剂的攻击靶标,例如新烟碱类杀虫剂。乙酰胆碱受体(nAChRs)由五个亚基组成的五聚体,因此昆虫nAChRs理论上会有不同的组成多样性。在对模式农业害虫东亚飞蝗(Locusta migratoria)受体亚基分析中发现,存在6种α亚基存在选择性剪接情况。如Locα1,Locα6和Locα9在Loop D中出现保守氨基酸的缺失;Locα8胞内大环出现了 34个氨基酸的插入序列;Locα4,Locα7和Locα9终止密码子提前导致缩短的转录本序列。在非洲爪蟾卵母细胞中,利用一个蝗虫α亚基(包括:Locα1-α5,Locα8,Locα9)与大鼠β2亚基共表达出杂合受体,并研究了 Locα1,Locα8和Locα9选择性剪接对激动剂ACh效能的影响。结果表明Locα1和Locα9可以增加杂合受体对ACh的敏感性;然而,Locα8表现出对电流的显著性改变。这些结果清楚地显示,无论是在结合位点及其临近区域,甚至在远离结合位点的胞内区的选择性剪接都会改变受体对激动剂效能。因此,选择性剪接现象在药理学和功能上增加了nAChRs多样性。二、东亚飞蝗吡虫啉两个不同亲和力位点烟碱型乙酰胆碱受体β亚基的分布因为昆虫体内nAChRs的多样性,β亚基可能参与多种受体的组成。在东亚飞蝗中枢神经系统转录组中发现第3个β型亚基序列,这表明这种模式农业害虫至少有3个β亚基的存在。在蝗虫中枢神经系统中发现吡虫啉具有两种不同亲和力的结合位点,Kd值分别为0.16 nM和10.31 nM。利用3种β亚基胞内大环氨基酸分别制备了三种特异性抗体(L1-I,L2-I和L3-I)。使用L1-I对Locβ1免疫消除导致低亲和力结合位点选择性消失,然而L3-I则会导致高亲和力位点选择性的丢失。在对膜蛋白进行L1-I和L3-I双重免疫消除后发现2种结合位点的完全消失。与之相反的是L2-I对[3H]imidacloprid配基结合结果没有明显影响。由此表明蝗虫的Locβ1和Locβ3分别参与低亲和力和高亲和力结合位点的构成,这与褐飞虱Nlβ1参与2种吡虫啉结合位点形成不同。2个β亚基参与不同亲和力位点的形成降低了 β亚基点突变导致的吡虫啉抗性的风险。三、拟环纹豹蛛乙酰胆碱受体鉴定分析拟环纹豹蛛是稻田生态系统中重要的捕食性天敌,有研究表明新烟碱类杀虫剂对其表现出低毒、低选择性。本章通过转录组测序,获得了拟环纹豹蛛丰富的靶标基因(nAChRs)信息,并对其进行了分析鉴定。对9个转录组库中注释为nAChRs基因片段进行了鉴定分析,排除错误注释及不确定序列后,共有63条确定为乙酰胆碱受体的Unigenes数,并且发现了 5条新的序列,其中4条为α亚基,1条为β亚基。在对已知的α亚基氨基酸序列比对后,分别将c59396_g1命名为ppα6_variant B;c42994_g1 和 c47708_g1 分别命名为 ppα4 和 ppα5;c29060_g2 暂命名为 ppα9。对新发现的β亚基(c56827_g1)氨基酸序列比对后命名为β4亚基。系统进化分析结果显示,拟环纹豹蛛的nAChRs基因相比于昆虫具有相似的亚分类。对具有完整开放阅读框的nAChRs亚基进行基因组Map和外显子预测时,一共有4条基因可以完整地Map到一条scaffold上,并且每个基因具有7-8个外显子组成。这些结果不仅丰富了拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体基因信息,也促进了对拟环纹豹蛛与新烟碱类杀虫剂互作研究的深入,为新烟碱类农药在天敌-昆虫间选择性机制的理解和高效选择性农药的研发提供必要理论基础。