本文对保护素DX对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响及机制进行了研究。本研究分为三个部分：　　第一部分：小鼠肺纤维化模型的建立及肺功能测定。　　目的：气管滴注博来霉素（ bleomycin， BLM）建立小鼠肺纤维化（ Pulmonary Fibrosis,PF）模型并观察肺功能的变化。　　方法：⑴雄性C57BL/6小鼠（20-25g）麻醉后，单次气管滴注不同剂量BLM(1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg)以建立肺纤维化模型,正常对照组给予相同体积的生理盐水。随后每天记录体重。⑵给药7天后，麻醉，腹主动脉放血处死动物。肺组织行HE染色和Masson染色，光镜下观察病理学变化，并利用Ashcroft评分评估纤维化程度。⑶给药7天后，麻醉，气管切开，造口，连接Y型管，尾静脉注射维库溴铵麻痹呼吸肌，连接小动物肺功能测试仪（flexiVent）测试肺功能，观察深吸气量（IC）的变化，在浓度梯度的乙酰甲胆碱（Mch）（0=生理盐水、3、9和27mg/ml）激发下，观察呼吸系统阻力（Rrs）、呼吸系统弹力（Ers）、中心气道阻力（Rn）、肺组织回弹力（H）、肺组织刚性（G）的变化情况。　　结果：①与空白组比较，BLM（1.0 mg/kg）组小鼠体重与正常对照组相比基本相差无异。BLM（2.0 mg/kg、3.0 mg/kg）组,小鼠体重在给药后7天呈进行性下降。BLM（3.0 mg/kg）组体重下降最为明显。②选取BLM(2.0mg/kg)为最佳造模剂量。HE染色可见 BLM组小鼠肺泡原有结构破坏，肺泡腔内呈现炎性细胞大量浸润， Masson染色所示肺组织内出现大量胶原纤维沉积，Ashcroft评分明显高于对照组（P＜0.01）。在肺功能检测实验中，使用flexiVent肺功能检测仪，与正常对照组相比，BLM(2.0mg/kg)组小鼠IC显著降低（P＜0.01），在Mch激发下，Ers、Rrs、Rn、G和H均有不同程度的升高。　　结论：博来霉素给药第7天，小鼠出现体重下降，肺部出现大量炎性浸润、肺组织胶原沉积，纤维化已经开始形成，小鼠肺纤维化模型成功建立。在炎症和纤维化的影响下，整个呼吸系统（包括肺组织和中心气道）肺功能受损严重。　　第二部分：保护素DX在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中的作用及机制。　　目的：研究保护素DX（PDX）对BLM诱导的小鼠肺纤维化的作用及肺功能的影响并探讨其可能机制。　　方法：本部分实验分五组：正常对照组、BLM（2.0mg/kg）组、BLM（2.0mg/kg）+PDX组、BLM+乙醇（溶剂对照）组、PDX组。 BLM给予当天记为造模第0天。在BLM给药后的第8天腹腔给予PDX(1μg/mouse),随后隔天追加PDX（100ng/mouse）至第21天。实验一：造模第21天，腹主动脉放血处死动物。左侧肺组织用多聚甲醛固定，肺组织行 HE染色和 Masson染色，光镜下观察病理学变化，并利用Ashcroft评分评估纤维化程度。右肺用于羟脯氨酸含量、酶联免疫吸附法（ELISA）测定、Western blot的检测。实验二：造模第21天，腹主动脉放血处死动物。左侧肺组织戊二醛固定，电镜下观察肺组织肺泡结构、肺泡腔、细胞和细胞器等超微结构的改变。实验三：造模第21天，麻醉，气管切开，造口，连接Y型管，尾静脉输注维库溴铵麻痹呼吸肌，连接小动物肺功能测试仪（flexiVent）测试肺功能，观察深吸气量（IC）、压力容量环（Pressure-Volume loop，PV loop）曲线及相关参数改变，在浓度梯度的乙酰甲胆碱（Mch）（0=生理盐水、3、9和27mg/ml）激发下，观察呼吸系统阻力（Rrs）、呼吸系统弹力（Ers）、中心气道阻力（Rn）、肺组织回弹力（H）、肺组织刚性（G）变化情况。实验四：造模第21天，麻醉，小鼠腹主动脉取血，使用血气功能分析仪（ABL90,FLEX）进行血气分析。实验五：实验第0天给予BLM（3.0mg/kg）, PDX给药方法如前述，记录体重，描绘生存曲线并进行分析。　　结果：①HE染色及Masson染色结果所示：BLM组小鼠肺组织较空白组显示出肺泡结构破坏伴有炎性细胞大量浸润，弥漫的胶原纤维沉积，间质纤维化形成， BLM+PDX治疗组小鼠显示出纤维化程度较BLM组有明显减轻，Ashcroft评分显著降低（P＜0.01），炎性浸润减轻。BLM+乙醇组小鼠与BLM组相比，肺组织表现相较无异。单独给予PDX组与空白组相比，肺组织也无明显差异。②电镜下观察：与空白组相比，BLM组胶原纤维堆积在肺泡内，视野内肺泡二型上皮细胞数量减少，细胞内线粒体肿胀，板层小体稀疏，呈现空泡状，给予PDX干预治疗后，视野内可见基底膜完整，胶原纤维沉积减少，肺泡腔干净。③羟脯氨酸结果显示PDX明显降低BLM诱导的羟脯氨酸表达（P＜0.01）。④ELISA结果显示BLM组IL-1β， IL-17，TNF-α和促纤维化因子TGF-β显著升高，PDX可明显降低上述因子的表达（P＜0.01）。⑤Western blot和免疫组化结果显示，与正常对照组相比，BLM组小鼠肺组织内 E-钙粘蛋白（ E-cadherin）表达显著减少， N-钙粘蛋白（ N-cadherin）,肌动蛋白α（α-SMA）表达显著升高，PDX干预后逆转这些蛋白改变的趋势。⑥与BLM组相比，BLM+PDX治疗组IC显著升高趋于正常（P＜0.01），PV loop闭环曲线上移。⑦血气分析结果显示，BLM组的小鼠动脉氧饱和度（SaO2）,动脉氧分压（PaO2）显著下降，PH、动脉二氧化碳（PaCO2）、乳酸（Lac）并未出现显著改变，BLM+PDX治疗组纠正了SaO2,PaO2的降低。⑧生存实验结果显示，给予PDX干预BLM诱导的小鼠纤维化后，小鼠体重呈现上升趋势，死亡率下降。　　结论：PDX可抑制BLM诱导的纤维化相关细胞因子的表达，同时减轻BLM诱导的小鼠纤维化，促进纤维化消退，最终改善小鼠肺功能,改善血气交换能力,从而提高小鼠生存率。　　第三部分：保护素DX对TGF-β1诱导的原代肺泡二型上皮细胞EMT的影响。　　目的：探索PDX对TGF-β1诱导的肺泡二型上皮细胞(AT II) EMT的影响。　　方法：①不同剂量TGF-β1（1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml）分别作用原代肺泡二型上皮细胞24h、48h、72h，提取细胞总RNA，用实时荧光定量PCR法检测细胞内E-cadherin、N-cadherin RNA表达水平。②不同剂量PDX（100nM、10nM、1nM）与TGF-β1（10ng/ml）共同作用原代肺泡二型上皮细胞48h后，Western blot检测上皮细胞特异性蛋白E-cadherin、间质细胞特异性蛋白 N-cadherin、α-SMA的表达水平。　　结果：与正常对照组比较，TGF-β1（10ng/ml）作用于原代肺泡二型上皮细胞48h后可观察到E-cadherin蛋白表达明显减少（P＜0.01），N-cadherin蛋白水平明显升高（P＜0.01）。给予PDX干预后，PDX剂量依赖性促进E-cadherin蛋白表达，抑制α-SMA、N-cadherin蛋白表达（P＜0.01）。　　结论：TGF-β1诱导上皮细胞发生上皮间质转化（EMT），PDX可剂量依赖性抑制EMT过程。