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1.目的:研究以补气益肺组方的“六味补气方”对COPD气道重塑和TGF-β/Smads信号通路的影响及其可能的作用机制,试图揭示补气益肺方治疗COPD模型大鼠可能的作用靶点、环节和途径,为临床进一步优化治疗COPD获取证据。2.方法:选取雄性SPF级SD大鼠100只,按随机数字表法选取15只作为正常对照组,其余大鼠于实验第1天和第14天采用气管内滴入脂多糖(LPS)加烟熏双因素联合建立COPD实验动物模型,造模周期12周。将造模成功后的大鼠按随机数字表法分为5组:模型组、六味补气方高剂量组、六味补气方中剂量组、六味补气方低剂量组、桂龙咳喘宁组(阳性对照组)。正常对照组和模型组灌服生理盐水,剂量为10ml/kg·d,六味补气方各剂量组灌服六味补气方混悬液,高、中、低剂量组剂量分别为1.06g/kg·d、0.53g/kg·d、0.265g/kg·d(相当于成人临床常规用量的20倍、10倍、5倍),桂龙咳喘宁组灌服桂龙咳喘宁片混悬液,剂量为0.82mg/kg·d(相当于成人临床常规用量的10倍),各组均于造模第9周的第1天开始药物干预,每日2次,疗程为12周。每天观察大鼠生物学特性变化;药物干预结束后测定肺功能;HE染色检测肺组织病理学变化;ELISA法检测血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1水平;免疫组化法检测肺组织MMP-9和TIMP-1表达;Western Blot测定肺组织TGF-β1、p-Smad2/3、Muc5ac、Col-I、a-SMA蛋白表达;RT-PCR法检测肺组织中TGF-β1、Smad2/3、Muc5ac、Col-I、a-SMA m RNA水平。3.结果3.1生物学特性变化正常对照组大鼠呼吸均匀平稳,无咳嗽咳喘,口鼻干净,无分泌物,毛发有光泽,活动度正常,反应灵敏,体重平稳增长,进食进水量正常,二便正常,舌红润。模型组大鼠呼吸急促,甚者张口呼吸明显,时有咳嗽咳喘,口鼻有分泌物,皮毛无光泽,部分有脱毛现象,活动迟缓,倦怠蜷缩,反应迟钝,汗出,体重增长较其它组慢,进食进水量减少,大便稀溏,舌紫暗,有瘀点瘀斑。六味补气方各剂量组和桂龙咳喘宁组大鼠一般特征和呼吸系统症状较正常对照组差,较模型组好,体重自第9周给药后增长趋势较模型组加快。六味补气方各剂量组和桂龙咳喘宁组各组之间大鼠一般特征和呼吸系统症状无明显差异。3.2肺功能变化与正常对照组相比,模型组大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均下降显著(P<0.01)。与模型组相比,六味补气方高剂量组和桂龙咳喘宁组FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均显著升高(P<0.01);六味补气方中、低剂量组FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明显升高(P<0.01或P<0.05),FEV0.3值升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。与桂龙咳喘宁组相比,六味补气方高剂量组FVC、FEV0.3值升高明显(P<0.01或P<0.05),FEV0.3/FVC(%)和PEF值升高,差异无统计学意义(P>0.05);六味补气方中剂量组FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC(%)和PEF值降低,差异无统计学意义(P>0.05);六味补气方低剂量组FEV0.3值降低明显(P<0.05),FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值也降低,差异无统计学意义(P>0.05)。3.3肺组织病理学变化正常对照组大鼠各级支气管黏膜纤毛柱状上皮完整,呼吸道及肺泡上皮结构完整,纤毛排列整齐,平滑肌完整,无纤维组织增生,肺泡组织形态结构完整。模型组大鼠各级支气管黏膜纤毛柱状上皮不完整,纤毛上皮部分剥脱、杯状细胞增多、黏液腺体增生肥大;支气管壁各层可见淋巴细胞、巨噬细胞为主的炎细胞浸润;支气管管壁与正常对照组比较增厚明显,细支气管腔内可见黏液栓;肺泡腔不规则扩大,部分肺泡破裂融合成肺大泡。六味补气方各剂量组和桂龙咳喘宁组上述病理学均有不同程度的改善,以六味补气方高剂量组改善最为明显。3.4肺组织MMP-9和TIMP-1表达的变化正常对照组大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1阳性细胞数量少,呈阴性或弱阳性表达;模型组大鼠MMP-9和TIMP-1阳性细胞数量较多,呈强阳性表达;六味补气方各剂量组和桂龙咳喘宁组大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1阳性细胞数量减少,表达减弱,其中,六味补气方高剂量组呈弱阳性表达。六味补气方中剂量组和桂龙咳喘宁组呈中度或弱阳性表达,六味补气方低剂量组大鼠MMP-9和TIMP-1呈中度表达。3.5血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1水平变化与正常对照组相比,模型组血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比,六味补气方高剂量组和桂龙咳喘宁组血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1水平下降显著(P<0.01或者P<0.05),其中,以六味补气方高剂量组下降最为明显。与桂龙咳喘宁组相比,六味补气方高剂量组血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1水平下降,但差异无统计学意义(P>0.05);六味补气方中、低剂量组血清中TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1水平均有所升高,其中六味补气方低剂量组血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8水平升高明显(P<0.01或P<0.05)。3.6肺组织TGF-β1、Smad2/3、Muc5ac、Col-I、a-SMA蛋白表达和m RNA水平的变化与正常对照组相比,模型组TGF-β1、Smad2/3、Muc5ac、Col-I、a-SMA蛋白表达量和m RNA水平升高显著(P<0.01)。与模型组相比,六味补气方高剂量组和桂龙咳喘宁组TGF-β1、Smad2/3、Muc5ac、Col-I、a-SMA蛋白表达量和m RNA水平明显降低(P<0.01或P<0.05),以六味补气方高剂量组降低最为明显。与桂龙咳喘宁组相比,六味补气方高剂量组降低,但差异无统计学意义(P>0.05);六味补气方中、低剂量组升高,六味补气方低剂量组升高显著(P<0.01)。4.结论4.1六味补气方可减轻COPD模型大鼠肺组织病理学变化,增加肺通气功能。4.2六味补气方可通过降低模型动物肺组织MMP-9与TIMP-1相对表达量,从而起到缓解气道重塑的作用。4.3六味补气方通过抑制相关炎症细胞因子释放,改善气道重塑。4.4通过调控TGF-β/Smads细胞信号通路相关蛋白表达和基因水平,可能是六味补气方干预COPD气道重塑的靶点之一。