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目的:
通过RNA干扰(RNAi)技术特异性沉默大鼠胸主动脉平滑肌细胞(CRL-1444)高血压相关基因FXYD5的表达,探索该基因在高血压发病机制中的作用。
方法:
设计并合成4个针对大鼠FXYD5基因的特异性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4),以含非特异性编码序列的siRNA-con为对照。复苏并传代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(CRL-1444)至5~10代,将上述4个片段及阴性对照通过阳离子脂质体法转染进CRL-1444内,通过激光共聚焦显微镜估算转染效率后经RT-PCR初步筛选,siRNA-1、siRNA-2两组的RNA干扰效率较明显,用real-time PCR定量检测该两组FXYD5的mRNA表达水平,进而采用CCK-8法检测FXYD5基因特异性沉默后对平滑肌细胞增殖效应的影响,采用划痕法(Woundhealing法)检测FXYD5基因特异性沉默后对细胞迁移力的影响以及采用超微量Na+-K+-ATPase测试盒检测FXYD5基因特异性沉默后对细胞膜Na+-K+-ATPase活性的影响。
结果:
荧光实时定量PCR结果显示siRNA-1使FXYD5的mRNA表达与空白对照组(Blank)相比下降86.71%,差异有统计学意义(P=0.004,P<0.01);siRNA-2使FXYD5的mRNA表达与空白对照组(Blank)相比下降90.17%,差异有统计学意义(P=0.003,P<0.01);对照组siRNA-con与空白对照组(Blank) FXYD5的mRNA表达差异无统计学意义(P=0.996,P>0.01)。CCK-8法结果显示siRNA-1、siRNA-2两组与对照组间细胞增殖能力无明显差异(P>0.01)。划痕法检测细胞迁移力结果显示siRNA-1和siRNA-2转染组平滑肌细胞迁移力低于siRNA-con转染组和空白对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P<0.01),对照组siRNA-con与空白对照组(Blank)平滑肌细胞迁移力差异无统计学意义(P=0.932,P>0.01)。Na+-K+-ATPas活性检测结果显示siRNA-1和siRNA-2转染组平滑肌细胞Na+-K+-ATPas活性低于siRNA-con转染组和空白对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P<0.01),对照组siRNA-con与空白对照组(Blank)平滑肌细胞Na+-K+-ATPas活性差异无统计学意义(P=0.017,P>0.01)。
结论:
RNA干扰技术能特异性沉默大鼠胸主动脉平滑肌细胞的FXYD5基因的表达水平;特异性沉默FXYD5基因表达后血管平滑肌细胞的增殖能力无明显变化,而细胞迁移力和细胞膜的Na+-K+-ATPase活性明显降低,初步揭示了FXYD5基因的潜在功能以及在高血压发病机制中可能扮演的角色。FXYD5基因可能是高血压病新的相关基因。