【摘 要】
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目的:特发性肺纤维化（IPF）是一种典型的与年龄相关且具有高死亡率的不可逆纤维化疾病,研究表明,其发生与细胞外基质（ECM）过度沉积、上皮-间质转化（EMT）以及炎症反应密切相关。目前广地龙对呼吸系统疾病的临床应用较为广泛,但其具体作用机制仍不清楚。本课题系统研究鲜广地龙粗提物的抗特发性肺纤维化活性及作用机制,并对鲜广地龙粗提物进一步纯化,初步探讨纯化蛋白P2的抗特发性肺纤维化活性。方法:（1）采
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目的:特发性肺纤维化（IPF）是一种典型的与年龄相关且具有高死亡率的不可逆纤维化疾病,研究表明,其发生与细胞外基质（ECM）过度沉积、上皮-间质转化（EMT）以及炎症反应密切相关。目前广地龙对呼吸系统疾病的临床应用较为广泛,但其具体作用机制仍不清楚。本课题系统研究鲜广地龙粗提物的抗特发性肺纤维化活性及作用机制,并对鲜广地龙粗提物进一步纯化,初步探讨纯化蛋白P2的抗特发性肺纤维化活性。方法:（1）采用鲜广地龙为研究对象,通过液氮冷冻和缓冲溶液提取获得鲜广地龙粗提物。建立由博来霉素气管滴注诱导的特发性肺纤维化小鼠模型,采用HE染色和Masson染色检测鲜广地龙粗提物对肺纤维化小鼠的肺损伤和肺纤维化的影响;采用（RT-qPCR法）和（Western blot法）检测鲜广地龙粗提物给药前后血清中 α-SMA、Vimentin、Collagen I、Fibronectin 和 E-cadherin 的表达。采用流式细胞术分析肺纤维化小鼠的肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞的表达。采用Elisa试剂盒分析炎症因子IL-2的表达。（2）采用凝胶排阻色谱法分离纯化鲜广地龙粗提物,获得鲜广地龙纯化蛋白。通过质谱和生信分析对P2蛋白进行成分和功能分析。（3）采用CCK8-法检测P2蛋白对人胚肺成纤维细胞的细胞毒性和对肌成纤维细胞增殖的影响,流式细胞术检测其对肌成纤维细胞的凋亡影响。RT-PCR 法和 Western blot 法检测其对 α-SMA、Vimentin 和 E-cadherin 因子的mRNA表达和蛋白表达。结果:（1）2.5mg/ml的鲜广地龙粗提物可以抑制α-SMA、Vimentin、Collagen I、Fibronectin的mRNA表达和蛋白表达（P＜0.05）,同时升高E-cadherin的mRNA和蛋白表达表达（P＜0.01）,2.5mg/ml的鲜广地龙粗提物能降低巨噬细胞和中性粒细胞的含量（P＜0.01）,且呈剂量依赖性,1.25mg/ml的鲜广地龙粗提物对IL-2等炎症因子的抑制效果显著（P＜0.05）。（2）凝胶排阻色谱分离纯化鲜广地龙粗提物获得5个洗脱峰,分别命名为P1（50-115 kDa）、P2（40-125 kDa）、P3（15-100kDa）、P4（5-15kDa）和P5（无）,其中第二个峰的紫外吸收信号最强,初步选择P2进行后续实验。质谱分析结果显示在本实验设定的检测条件下,鲜广地龙纯化蛋白（P2）中共包含人源蛋白91个,生信分析结果结果表明,P06702蛋白是一种钙和锌的结合蛋白,在调节炎症和纤维化过程中起着重要的作用。细胞活力实验结果显示,鲜广地龙纯化蛋白（P2）具有抑制肌成纤维细胞的增殖作用（P＜0.01）,并可降低 α-SMA、Vimentin 的 mRNA 和蛋白表达（P＜0.05）,同时升高E-cadherin的mRNA表达和蛋白表达（P＜0.01）。凋亡流式实验结果显示,鲜广地龙纯化蛋白（P2）具有凋亡肌成纤维细胞的作用（P＜0.05）。结论:鲜广地龙粗提物具有抗特发性肺纤维化活性,可能与降低纤维化标志物α-SMA、Vimentin、Collagen I、Fibronectin 的的 mRNA 表达和蛋白表达,同时升高E-cadherin,抑制TGF-β1/Smad2/3通路激活有关。凝胶排阻色谱得到的鲜广地龙纯化蛋白（P2）可通过抑制肌成纤维细胞表达,降低纤维化标志物α-SMA、Vimentin,升高E-cadherin等起到体外抗肺纤维化的作用。
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