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研究背景:急性心肌梗死(AMI)是由冠状动脉急性闭塞导致的心肌持续性缺血、缺氧而出现缺血坏死。心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)是影响冠状动脉闭塞血管再通后治疗效果的主要原因,内质网应激(ERS)参与了MI/RI中钙离子超载、氧化应激以及细胞凋亡的调控,是MI/RI发生发展中的重要病生理过程。目的:细胞FLICE抑制蛋白(cFLIP)是细胞凋亡的重要调节因子,在内质网的调节中起着重要作用。本研究旨在探讨长链cFLIP(cFLIPL)对MI/RI细胞凋亡的影响及ERS相关调控机制,以期为寻找防治MI/RI的有效干预靶点提供新的理论依据。方法:(1)细胞实验:使用重组腺病毒感染大鼠心肌细胞H9C2细胞株72 h后进行缺氧4 h复氧12 h处理,随机分成四组:空白对照组(Control组)、缺/复氧组(H/R组)、H/R+空载腺病毒阴性对照组(Ad-NC组)、H/R+过表达cFLIPL腺病毒组(Ad-cFLIPL组)。采用不同的病毒感染复数来感染H9C2细胞,通过CCK-8评估心肌细胞活力、荧光显微镜观察病毒感染效率,使用Western Blot检测凋亡和内质网应激相关蛋白表达水平。此外,使用内质网应激的激动剂衣霉素(TM)预处理细胞,Western Blot检测Ad-NC组和cFLIPL组在预处理前后内质网应激相关蛋白的表达变化。为了进一步探索其中机制,在预处理培养基中加入丝裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)抑制剂,蛋白免疫共沉淀(Co-IP)验证cFLIPL蛋白和p38之间的相互作用关系。(2)动物实验:采用心肌心尖部多点注射法感染重组腺病毒3 d后,将60只SD大鼠(220~250g)按照随机法分为4组,每组约15只,分别为:假手术组(Sham组)、心肌缺血/再灌注损伤手术组(I/R组)、I/R+Ad-NC组、I/R+Ad-cFLIPL组。在肺动脉圆锥与左心耳根部之间找到冠状动脉左前降支,使用丝线和凹槽乳胶管一起结扎诱导心肌缺血30 min,并再灌注2 h来构建MI/RI模型。荧光显微镜观察组织绿色荧光表达,血清心肌酶检测心肌细胞损伤程度,TTC染色检测不同分组的心肌梗死面积,HE染色评估组织形态改变,TUNEL法检测心肌细胞凋亡率,此外,Western Blot检测心肌组织中内质网应激相关蛋白的表达水平。结果:(1)细胞实验:(1)cFLIPL蛋白在H/R诱导的心肌细胞损伤中的表达显著下降,凋亡标志物pro Caspase-3和内质网膜蛋白GRP78表达量也相应减少;感染MOI=100的重组腺病毒可达90%感染效率且对细胞活力影响不大。(2)感染重组腺病毒Ad-cFLIPL可上调cFLIPL的蛋白表达,与Ad-NC组相比,过表达cFLIPL可显著减轻H/R诱导的心肌细胞的凋亡率(P<0.05),Western Blot检测凋亡相关蛋白。(3)使用Western Blot检测内质网应激相关蛋白发现,H/R显著诱导了GRP78、IRE1、PERK、ATF6、CHOP的活化和pro Caspase-12的裂解,除外ATF6,而过表达cFLIPL可明显抑制这些ERS相关蛋白的表达及活化(P<0.05)。(4)Western Blot检测p38 MAPK蛋白发现,与Control组相比,磷酸化p38(p-p38)表达随cFLIPL上调而降低,总p38(total p38)表达随cFLIPL上调而升高(P<0.05)。免疫共沉淀验证cFLIPL蛋白与total p38蛋白之间存在直接相互作用。(5)为了进一步验证p38MAPK与ERS之间的关系,我们增加了p38抑制剂SB203580组,Western Blot结果显示,在H/R诱导的ERS激活过程中,SB203580显著下调了GRP78、IRE-1和PERK蛋白的水平,这与Ad-cFLIPL组的结果一致(P<0.05)。(6)内质网应激激动剂衣霉素(TM)预处理后Ad-NC组较Ad-cFLIPL组细胞损伤和凋亡更为严重(P<0.05)。(2)动物实验:(1)感染重组腺病毒后,可在Ad-NC组和Ad-cFLIPL组中观察到绿色荧光。(2)与Sham组相比,MI/RI显著下调cFLIPL的蛋白表达,感染Ad-cFLIPL后可上调心肌组织中cFLIPL蛋白表达(P<0.05)。(3)大鼠心肌组织HE染色结果显示,过表达cFLIPL显著减少了I/R引起的广泛中性粒细胞浸润、细胞水肿以及心肌纤维断裂。(4)TUNEL染色显示I/R后凋亡细胞增加了21.97±2.63%,而cFLIPL上调逆转了这一效应,与Ad-NC组相比,过表达cFLIPL可减少细胞凋亡(22.3±2.98%vs.12.42±1.04%,P<0.05)。(5)使用TTC染色评估各组大鼠心肌梗死面积显示,与Sham组相比,I/R组中梗死面积约30.6%±1.68%,上调cFLIPL表达后最终梗死面积显著减少(P<0.05)。(6)I/R诱导的心肌组织损伤导致血清中CKMB和LDH的大量释放,而过表达cFLIPL可减轻这一损伤降低血清CKMB和LDH的水平。(7)使用Western Blot检测ERS相关蛋白发现,与Sham组相比,I/R损伤诱导了GRP78、IRE1、PERK、pro Caspase-12、cleaved Caspase-12、CHOP和cleaved Caspase-3的蛋白高表达,而上调cFLIPL可显著抑制这些蛋白的活化或裂解(均P<0.05)。结论:心肌在经MI/RI处理后cFLIPL的表达明显下调,内质网应激诱导的凋亡大量发生,本研究验证了过表达cFLIPL蛋白可有效减轻H/R和I/R诱导的心肌细胞损伤,作用机制之一是通过抑制内质网应激诱导的凋亡来发挥心肌的保护作用,为寻找防治MI/RI的有效干预靶点提供了新的理论依据。