论文部分内容阅读
甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）起源于甲状腺滤泡上皮细胞。近年来,甲状腺癌的发病率不断增加,已逐渐成为最常见的内分泌恶性肿瘤。PTC作为甲状腺癌的主要亚型（约占80%）,主要发生在年轻妇女和儿童中。尽管早期PTC患者的预后良好,但晚期PTC患者的5年生存率仅约59%。因此,迫切需要找到更有效的治疗PTC策略。环状RNA（circRNA）是一类新型的内源性非编码RNA分子,其特征是没有5’-3’极性和多聚A尾的共价闭环结构。它们丰富、保守、稳定地存在于不同组织中,并且显示时空特异性。CircRNAs是新兴的非编码RNA分子,有些被认为是癌症的生物标志物和调节子。研究人员发现,circRNA可能在多种癌症中发挥抑癌或促癌作用。CircRNA核受体相互作用蛋白1（circNRIP1）,是新发现的circRNA,有研究发现它在胃癌中表达异常升高,且其发挥着促进胃癌进展的作用。但是circRNA NRIP1在PTC中的表达情况仍未有相关报道,在PTC中的作用也未知。MicroRNAs（miRNAs）是一类保守的内源性小非编码RNA,它们通过降解mRNA分子或抑制其翻译而导致其靶基因沉默。MiRNAs参与多种生物学事件,包括肿瘤发生和转移,这表明它们在多种人类恶性肿瘤的发病机理中具有至关重要的作用。异常上调的miRNAs,例如miR-146b、miR-222、miR-221 和miR-151,被认为与PTC的发展有关,特别是与PTC的转移有关。MiR-195-5p在多种类型的人类癌症（包括PTC）中显著下调,并显示出抑癌的作用。在PTC相关研究中发现与正常甲状腺组织相比,miR-195在PTC中表达下调。然而,miR-195在PTC中的作用尚未得到证实,miR-195调节在甲状腺癌中的分子机制仍不清楚。本研究前期通过StarbaseV2.0等生物信息学在线分析得出,circRNA NRIP1与miR-195-5p存在靶向互补序列,暗示两者可能存在某种调节关系。本研究旨在检测和分析circRNA NRIP1与miR-195-5p在PTC中的表达情况,以及circRNANRIP1与miR-195-5p在PTC中的功能及其可能的机制,为PTC的基因治疗提供新的潜在靶点。本研究首先收集PTC组织及癌旁正常甲状腺组织样本,HE检测二者组织形态学差异,并检测了PTC肿瘤组织和PTC细胞系中circRNANRIP1和miR-195-5p的表达水平,分析了二者在PTC组织中表达的相关性;另外,预测并验证了circRNANRIP1与miR-195-5p的关系,并分析了CircRNA NRIP1干扰对TPC1和IHH-4细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、P38 MAPK和JAK/STAT信号通路以及移植瘤生长的影响;最后探讨了circRNA NRIP1-miR-195-5p axis对TPC1、IHH-4细胞中增殖、侵袭、凋亡、迁移和P38 MAPK和JAK/STAT信号通路以及移植瘤生长的影响。本研究主要分为三部分:第一部分:CircRNANRIP1与miR-195-5p在PTC中的表达及意义;第二部分:CircRNANRIP1对PTC细胞恶性表型及移植瘤生长的影响;第三部分:CircRNANRIP1影响PTC细胞恶性表型及移植瘤生长的机制研究。主要内容:第一部分:CircRNANRIP1与miR-195-5p在PTC中的表达及意义方法1.收集PTC组织及癌旁正常甲状腺组织样本,HE检测二者组织形态学差异。2.利用qRT-PCR方法检测PTC肿瘤组织和对照癌旁组织、PTC细胞系包括TPC1、B-CPAP、IHH-4、K1 以及正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1 中circRNANRIP1和miR-195-5p的表达水平。3.分析不同临床分期PTC组织中circRNANRIP1和miR-195-5p的表达,及circRNANRIP1与miR-195-5p在PTC组织中表达的相关性。4.利用在线生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验分别预测和验证circRNANRIP1 与miR-195-5p的关系。结果1.HE检测结果发现PTC组织中存在分支状的乳头结构。2.与癌旁组织相比,PTC肿瘤组织中circRNA NRIP1明显高表达,miR-195-5p表达明显降低。3.与对照组Nthy-ori3-1 细胞相比,TPC1、B-CPAP、IHH-4、K1 中circRNA NRIP1表达明显升高,miR-195-5p表达明显降低,尤其是在TPC1和IHH-4细胞中。4.与Ⅰ/Ⅱ期PTC组织相比,在Ⅲ/Ⅳ期PTC组织中circRNANRIP1表达水平明显升高,miR-195-5p表达明显降低。5.PTC组织中circRNANRIP1与miR-195-5p的表达水平呈现负相关。6.在线生物信息学软件StarbaseV2.0预测和双荧光素酶报告基因实验验证circRNANRIP1 能够吸附miR-195-5p。第二部分:CircRNANRIP1对PTC细胞恶性表型及移植瘤生长的影响方法1.构建circRNA NRIP1干扰慢病毒载体,病毒包装和滴定后感染TPC1、IHH-4细胞。2.qRT-PCR检测TPC1 和IHH-4 细胞中circRNANRIP1 干扰效率。3.MTT检测circRNANRIP1干扰对TPC1和IHH-4细胞增殖的影响。4.流式细胞术检测circRNANRIP1干扰对TPC1和IHH-4细胞凋亡的影响5.Transwell实验检测circRNANRIP1干扰对TPC1和IHH-4细胞侵袭的影响。6.划痕实验检测circRNANRIP1干扰对TPC1和IHH-4细胞迁移的影响。7.Western blot检测circRNANRIP1干扰对TPC1和IHH-4细胞增殖、凋亡、侵袭、EMT的相关蛋白Ki67、Cleaved caspase-7、MMP-1、MMP-7、E-cadherin、Vimentin和α-SMA表达以及P38 MAPK和JAK/STAT信号通路的影响。8.利用TPC1细胞构建PTC移植瘤,探讨circRNA NRIP1干扰对PTC移植瘤生长的影响。结果1.与对照组相比,circRNANRIP1干扰组TPC1和IHH-4细胞中circRNA NRIP1表达明显降低。2.在TPC1和IHH-4细胞中,干扰circRNANRIP1表达能够明显抑制细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT以及P38 MAPK和JAK/STAT信号通路的活性,促进细胞凋亡。3.与对照组相比,干扰circRNANRIP1表达后Ki67、MMP-1、MMP-7、Vimentin和α-SMA表达水平明显降低,而E-cadherin、Cleaved caspase-7水平明显升高。第三部分:CircRNANRIP1影响PTC细胞恶性表型及移植瘤生长的机制研究方法1.构建miR-195-5p过表达、circRNA NRIP1过表达慢病毒载体,经病毒包装和滴定后感染细胞得到miR-195-5p过表达、circRNANRIP1过表达和miR-195-5p与circRNANRIP1同时过表达的TPC1和IHH-4细胞。2.qRT-PCR方法检测circRNANRIP1对miR-195-5p表达的影响。3.MTT检测circRNANRIP1-miR-195-5p axis对TPC1 和IHH-4 细胞中增殖的影响。4.流式细胞术检测circRNANRIP1-miR-195-5p axis对TPC1 和IHH-4 细胞中凋亡的影响。5.Transwell实验检测circRNANRIP1-miR-195-5p axis对TPC1 和IHH-4 细胞中侵袭的影响。6.划痕实验检测circRNANRIP1-miR-195-5paxis对TPC1 和IHH-4 细胞中迁移的影响。7.Western blot检测TPC1和IHH-4细胞中circRNA NRIP1-miR-195-5p axis对P38 MAPK和JAK/STAT信号通路相关蛋白p-p38、p38、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1表达的影响。8.利用TPC1 细胞构建PTC移植瘤,分析circRNANRIP1-miR-195-5p axis对PTC移植瘤生长的影响。结果1.qRT-PCR结果显示,circRNANRIP1过表达明显抑制miR-195-5p的表达,而干扰circRNANRIP1表达则促进miR-195-5p表达。2.在TPC1 和IHH-4 细胞中,circRNANRIP1-miR-195-5p axis通过促进P38 MAPK和JAK/STAT信号通路的活性,进而可以抑制细胞凋亡,促进TPC1和IHH-4细胞的增殖、侵袭和迁移以及PTC移植瘤的生长,从而发挥促癌的作用。全文结论1.与正常癌旁组织和正常细胞相比,在PTC组织和细胞中,circRNA NRIP1明显高表达,miR-195-5p明显低表达,二者在PTC组织中表达呈现负相关,且circRNANRIP1能够吸附并抑制miR-195-5p表达。2.在TPC1和IHH-4细胞中,干扰circRNANRIP1表达能够明显抑制细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT以及P38 MAPK和JAK/STAT信号通路的活性,促进细胞凋亡。3.CircRNA NRIP1通过影响miR-195-5p的水平可以促进P38 MAPK和JAK/STAT信号通路的活性,进而可以促进TPC1、IHH-4细胞的增殖、侵袭和迁移以及PTC移植瘤的生长,抑制细胞凋亡,从而发挥促癌的作用。