骨质疏松症（osteoporosis,OP）以骨量减低、骨组织微结构损坏和骨脆性增加为主要临床病理特征,临床表现为骨痛、骨骼变形和易骨折等。OP累及50%的绝经后女性和20%的50岁以上男性,且随着老龄化进程其发病率呈上升趋势。多数中老年人骨折是由OP引起,致使老年人生活质量下降,为患者家庭和社会带来沉重的经济负担。因而OP已成为严重影响人类健康的重要社会卫生经济问题。骨组织处于动态平衡以维持骨重建。破骨细胞（osteoclasts,OCs）通过合成分泌多种有机酸和蛋白酶溶解骨盐和降解有机质行使溶骨功能,介导骨吸收。成骨细胞（osteoblasts,OBs）形成骨组织基质和合成分泌核因子κB受体活化体配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）等骨代谢调控细胞因子,负责新骨形成。骨细胞由成骨细胞分化形成,合成分泌硬骨素（sclerostin）、RANKL等细胞因子参与骨代谢的调节。RANKL是骨重建的关键调控因子,通过与单核细胞巨噬细胞的核因子κB 受体活化体（receptor activator of nuclear factor κB,RANK）结合诱导 OCs 分化成熟。骨重建异常导致骨病发生,OCs分化成熟过度活跃是OP发生发展的主要病理标志。治疗OP主要选用药物。临床治疗OP药物种类繁多,双磷酸盐是最常用的一种。双磷酸盐通过调节OCs与OBs的相互作用对各种OP具有良好治疗作用,然而,长期使用双膦酸盐的安全性逐渐成为人们关注的问题。研究报道长期使用双磷酸盐引起下颌骨坏死、不典型转子下或股骨干骨折等不良反应。其他治疗OP的药物同样具有多种副作用,限制临床应用。所以需要研发副作用少、疗效高的新型抗OP药物。丹参（Salvia milorrhiza,SM）是一种具有活血化瘀、延缓衰老功能的中草药,临床用于治疗多种疾病。临床研究表明,SM治疗OP取得明显效果。体内实验证实SM对卵巢切除术（ovariectomy,OVX）引起的OP和糖尿病性OP有效。丹参酮是SM中提取的脂溶性有效成分可以抑制OCs活化,丹酚酸B是丹参的水溶性有效成分,可以抑制糖皮质激素性骨质疏松症（Glucocorticoid osteoporosis,GIOP）,改善骨小梁结构,增加骨密度。原儿茶醛（protocatechualdehyde,PCA）是丹酚酸B的衍生物,具有抗炎、抗菌等多种活性。PCA对体内佐剂性关节炎引起的股骨髁软骨破坏具有显著的抑制作用。然而,PCA是否能抑制OCs的活性具有治疗OP的潜力尚不清楚,本研究重点探讨PCA对OCs的分化成熟的影响及其机制,并基于小鼠OP模型探讨PCA对OP的作用,以验证PCA能否成为预防或治疗OP的新型药物。研究目的研究PCA对RANKL诱导破骨前体细胞（细胞株RAW264.7和骨髓源巨噬细胞BMMs）分化成熟为OCs的影响,并探讨其机制。另外建立OP模型小鼠观察PCA是否具有抑制骨丢失作用。为研究新型抗OP的药物提供理论基础。研究方法1.选择合适细胞株RAW264.7是一种来源于小鼠的单核巨噬细胞,能诱导分化为OCs,是本研究所用细胞株。2.获得骨髓源巨噬细胞BMMs取自6-8周雄性BALB/c小鼠的股骨,冲洗骨髓腔获得BMMs。3.动物模型的建立地塞米松（dexamethasone,Dex）（5 mg/kg/d）腹腔注射雄性BALB/c小鼠10周,建立GIOP模型。4.OCs的诱导RANKL诱导RAW264.7分化为OCs,RANKL和巨噬细胞集落刺激因（Macrophage Colony stimulating Factor,M-CSF）诱导 BMMs 分化为 OCs。5.PCA对细胞的活性影响的检测利用CCK-8试剂盒检测PCA对RAW264.7和BMMs细胞活性的影响,确定PCA的安全浓度。6.OCs的计数利用TRAP检测试剂盒对OCs进行染色,OCs标准是胞质TRAP阳性,且细胞核多而聚集大于3个。7.骨陷窝实验破骨前体细胞接种于Corning骨细胞培养板,诱导培养结束利用显微镜和Image J软件分析骨陷窝的面积。8.F-肌动蛋白（F-actin）检测细胞培养后,固定、透化,利用phalloidin试剂盒染色。荧光显微镜捕捉荧光图像。9.NF-κB p65核易位检测培养结束行细胞荧光染色。荧光正置显微镜观察NF-κBp65的表达。10.RT-qPCR 检测RT-qPCR检测组织蛋白酶K（cathepsin K,CTSK）、活化t细胞重组核因子1（Nuclear factor of activated T-cells c l,NFATC1）、细胞癌基因 fos（Proto-oncogene protein c-fos,c-Fos）、基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase 9,MMP9）、树突状细胞特异性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein,DC-STAMP）mRNA水平。11.蛋白水平检测细胞培养结束,收集细胞,提取总蛋白,western blot检测蛋白水平的变化。12.细胞免疫荧光检测细胞免疫荧光法检测LC3在细胞中的表达。13.microCT 检测通过microCT检测OP模型小鼠股骨微结构的变化,观察骨密度（BMD）、骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）等。14.H＆E染色通过H＆E染色观察小鼠的股骨石蜡切片组织形态学变化。15.微板法检测钙、磷水平通过钙磷检测试剂盒检测模型小鼠外周血离子的水平。实验结果1.实验所用最高浓度的PCA对细胞活性没有影响CCK-8法评估PCA对RAW264.7细胞和BMMs活性的影响。结果显示,实验中使用的PCA的最高浓度（5 μg/mL）对破骨前体细胞活性没有显著影响。2.PCA抑制RANKL诱导的OCs分化成熟RANKL诱导破骨前体细胞向OCs分化成熟,TRAP染色显示形成大而饱满的OCs,胞质中存在空泡,细胞核在胞质内多处积聚。当PCA存在时,OCs体积减小,空泡消失,细胞核聚集减少,表明PCA抑制OCs的分化成熟。3.PCA在OCs分化的早期抑制作用更明显5μg/mL PCA分别在1-2 d（早期）、3-4 d（晚期）、1-4 d（早期+晚期）三个时期加入到OCs诱导培养体系中。结果显示,PCA早期干预抑制作用更明显。4.PCA减少RANKL诱导的体外骨吸收为了探讨PCA对OCs骨吸收功能的影响,破骨前体细胞接种于Corning骨细胞板上培养4-8天。结果显示,RANKL组骨吸收陷窝明显,但有PCA干预时,骨吸收陷窝减少,提示PCA抑制OCs的骨吸收功能。5.PCA抑制F-actin的形成phalloidin染色结果显示PCA抑制F-actin形成。6.PCA抑制NF-κB p65核易位在PCA作用下研究NF-κB p65核易位。结果表明,RANKL组细胞核内p65荧光信号增强。然而PCA存在时,荧光强度减弱,入核的细胞数量减少,表明PCA显著抑制NF-κB p65核易位。7.PCA降低OCs标志物的mRNA表达水平RT-qPCR检测RANKL诱导分化过程中OCs的标记物CTSK、NFATC1、C-FOS、MMP9、DC-STAMP mRNA水平。结果显示,RANKL组上述因子的mRNA水平显著升高。然而当PCA存在时,基因表达水平显著下降,表明PCA可下调RANKL所致的mRNA水平的升高。8.PCA抑制MAPK信号通路的激活ERK、JNK和P38是MAPK通路主要成员。蛋白的磷酸化是激活的主要指标。在PCA缺失或存在的情况下Western blot检测OCs形成过程中上述蛋白的水平。结果显示,RANKL诱导后ERK、P38和JNK磷酸化水平显著升高。而PCA下调了 RANKL所致的P-ERK、P-P38和P-JNK蛋白的升高。9.PCA抑制NF-κB信号通路的激活RANKL诱导后磷酸化的p65升高显著。然而,当PCA存在时,p65磷酸化程度显著降低,表明PCA抑制NF-κB活化。Bayl 1-7082（NF-κB抑制剂）加入到OCs诱导体系中,结果显示Bayl1-7082存在时,形成的OCs显著减少,表明NF-κB在OCs活化成熟过程中的重要角色。10.PCA下调OCs的自噬水平诱导体系中加入自噬激活剂（Rap）,结果显示,自噬激活剂能显著促进OCs的形成,而且能逆转PCA对OCs形成的抑制作用,表明PCA抑制OCs分化成熟可能通过调节自噬而发挥作用。同时细胞免疫荧光检测OCs形成时自噬相关蛋白LC3的表达,结果显示,RANKL诱导形成的OCs的胞质和胞膜的免疫荧光显著增强,但当PCA存在时,荧光信号显著减弱。表明PCA抑制自噬相关蛋白LC3的表达,进一步证明了 PCA可能通过调节自噬而抑制OCs分化成熟。11.PCA可以减轻GIOP骨微结构指改变,减轻骨丢失MicroCT 3D成像显示,股骨近端对照组骨小梁粗,连续性好,无断裂,且成板层排列,Dex组骨小梁显著减少,骨小梁出现断裂不连续,骨髓腔内几乎没有骨小梁分布,Dex+PCA组骨小梁连续,但数量少成杆状,骨小梁较细。股骨远端,对照组干骺端骺线以上骨小梁致密,向近端骨髓腔延伸。Dex组骺线以上骨小梁显著减少,髓腔几乎无骨小梁延伸。Dex+PCA组骨小梁在骺线以上有分布。表明PCA能改善GIOP所致的的骨微结构的改变,减少骨丢失。12.PCA改善GIOP组织形态学改变H＆E染色结果显示,对照组骨小梁多且连续,骨小梁宽,而Dex组骨小梁显著减少,有断裂不连续,间隙增宽。PCA干预组骨小梁比较细,连续性尚好,表明PCA能逆转和改善GIOP所致的组织学改变。结论:PCA抑制RANKL诱导的OCs的形成,其机制为下调MAPK、NF-κB通路及自噬水平。同时PCA可以抑制GIOP的骨丢失,具有骨保护作用。PCA有望成为抗OP的候选药物。