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目的:(1)利用数据库分析miRNA-7的表达以及通过q PCR技术检测miRNA-7-5p在膀胱癌组织和细胞中的表达。(2)通过划痕实验和Transwell小室实验探究miRNA-7-5p对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响。(3)通过Western Blotting(WB)实验探索和电子显微镜观察miRNA-7-5p对膀胱癌细胞自噬水平的影响。(4)通过Transwell小室实验探究膀胱癌迁移侵袭能力和自噬水平高低的关系。(5)通过WB实验、双荧光素酶报告实验、免疫组化实验(IHC)以及生物信息学方法探究miRNA-7-5p与ATG7之间的调控关系。(6)通过CCK-8实验探索miRNA-7-5p和膀胱癌细胞顺铂耐药的关系。(7)通过小鼠皮下成瘤实验探究miR-7-5p在体内的影响。方法:(1)通过GEPIA2数据库分析miR-7在膀胱癌组织中的表达水平以及q PCR检测膀胱癌组织和细胞中miRNA-7-5p的表达水平。(2)使用转染试剂lipo8000分别转染miRNA-7-5p模拟物和抑制物,以及它们相对应的对照物。并用划痕实验和Transwell小室实验探究miRNA-7-5p对膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响。(3)利用WB实验检测miRNA-7-5p模拟物和抑制物处理后细胞自噬相关蛋白的表达量。电子显微镜观察膀胱癌细胞被miRNA-7-5p模拟物和抑制物处理后自噬小体的数量。(4)利用Transwell小室实验探究自噬诱导剂和抑制剂对膀胱癌细胞迁移侵袭的影响,并且探索miR-7-5p介导的细胞自噬水平和细胞迁移侵袭能力的关系。(5)采用生物信息学方法预测miRNA-7-5p的靶基因;采用WB、q RCR实验检测miRNA-7-5p模拟物对ATG7蛋白水平和m RNA水平的影响;将miRNA-7-5p mimic和mimic NC和ATG7的野生型及突变型质粒进行共转染,再利用双荧光素酶报告实验验证miRNA-7-5p和ATG7之间直接结合的作用;利用生物信息学方法和IHC方法分析ATG7在膀胱癌组织中的表达情况,WB实验检测ATG7在膀胱癌细胞中的表达情况;采用lipo8000转染ATG7过表达质粒和对照质粒,并用WB实验检测过表达ATG7对于miR-7-5p抑制的自噬水平影响的回复力。(6)利用CCK-8实验探究miRNA-7-5p对膀胱癌细胞耐顺铂的影响以及自噬水平和顺铂耐药的影响。(7)利用裸鼠皮下成瘤实验探究miR-7-5p在体内对移植瘤生长情况起到的作用;利用IHC实验检测相关蛋白的表达水平。结果:(1)GEPIA2数据库分析miR-7在404例膀胱癌组织和28例癌旁组织的表达水平,发现在癌组织中是下调的(p<0.05);在医院收集的47例癌组织和癌旁组织中,miR-7-5p在癌组织中的表达水平也是显著下调的(p<0.01),并且与SV-HUC-1细胞相比,miR-7-5p在T24T(p<0.01)和EJ(p<0.05)细胞中同样是低表达的水平;lipo8000转染miRNA-7-5p mimic,mimic NC,anti-miR-7-5p以及anti-NC。(2)Transwell小室实验发现,和对照组相比,过表达miR-7-5p显著抑制了膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,穿过Transwell小室的细胞明显减少(p<0.05);而抑制miR-7-5p表达显著促进了膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,穿过Transwell小室的细胞明显增加(p<0.05);划痕实验显示,过表达miR-7-5p显著抑制了膀胱癌细胞的伤口愈合面积(p<0.01);而抑制miR-7-5p表达显著促进了膀胱癌细胞的伤口愈合面积(p<0.01)。(3)WB实验发现过表达miR-7-5p后抑制了自噬相关蛋白Beclin 1的表达,促进了P62蛋白的表达,抑制了LC3B-Ⅰ蛋白向LC3B-Ⅱ转化;抑制miR-7-5p表达则得到的结果相反;透射电子显微镜观察发现,过表达miR-7-5p抑制了自噬小体的形成(p<0.05),而抑制miR-7-5p表达促进了自噬小体的形成(p<0.01)。(4)Transwell小室实验发现自噬促进剂也促进了膀胱癌细胞迁移和侵袭的能力,穿过Transwell小室的细胞显著增加(p<0.01);而自噬抑制剂则抑制了膀胱癌细胞迁移和侵袭的能力,穿过Transwell小室的细胞显著减少(p<0.01);由过表达miR-7-5p抑制的迁移侵袭力被自噬促进剂所逆转,过表达miR-7-5p穿过Transwell小室减少的细胞被加入的自噬促进剂明显逆转(p<0.01)。(5)WB实验显示过表达miR-7-5p抑制了ATG7的蛋白水平,q PCR结果显示ATG7的m RNA水平表达没有变化;双荧光素酶报告实验结果显示通过共转染ATG7-MUT与miR-7-5p mimic以及mimic NC,两组的荧光值没有明显差异,共转染ATG7-WT与miR-7-5p mimic以及mimic NC,两组的荧光值有明显差异(p<0.01);利用UALCAN数据库对膀胱癌组织中ATG7的表达进行分析,其中原发肿瘤408例,正常组织19例,发现肿瘤组织中表达水平明显增高(p<0.01);并根据肿瘤分期分析膀胱癌中ATG7的表达,其中正常组织19例,T1期2例,T2期129例,T3期137例,T4期132例。与正常组织相比,T2期、T3期和T4期ATG7的表达量显著上调(p<0.01);IHC实验显示在膀胱癌中ATG7蛋白的表达量高于正常组织;WB实验显示ATG7蛋白在膀胱癌细胞中的表达量高于正常尿路上皮细胞;WB实验结果显示,过表达ATG7可以逆转由过表达miR-7-5p所导致的低自噬水平。(6)CCK-8法发现与对照组相比,过表达miR-7-5p组显著抑制了在不同浓度顺铂下处理的膀胱癌细胞的存活率(p<0.01);当这些细胞也被自噬促进剂处理时,我们发现添加自噬促进剂逆转了miR-7-5p依赖性顺铂敏感性的增加(p<0.01);miR-7-5p和ATG7共转染细胞与自噬促进剂处理后的结果相似(p<0.01)。(7)裸鼠皮下成瘤实验发现,与miR-NC组相比,miR-7-5p组的肿瘤重量(p<0.05)和体积(p<0.01)更低。(C)免疫组化染色显示,转染miR-7-5p后,肿瘤组织中ATG7、Ki-67和N-cadherin蛋白表达降低,P62蛋白表达升高。结论:(1)miR-7-5p在组织样本和细胞系中的表达显著下调。(2)过表达miR-7-5p可显著抑制细胞自噬水平和迁移侵袭能力。(3)miR-7-5p直接靶向ATG7,提高了化疗对顺铂的敏感性。(4)miR-7-5p为膀胱癌潜在的肿瘤标志物和治疗靶点。