背景及目的:血管重塑是导致人类心血管事件的重要病理基础,也是高血压病导致机体并发症如脑卒中、心力衰竭及肾功能衰竭的主要原因之一。血管平滑肌细胞是动脉血管的主要成分,血管平滑肌表型转化是血管重塑的关键过程。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）可通过多条信号通路作用于平滑肌细胞,促进其发生表型转化等,进而促进血管重塑,因此被认为是高血压血管重塑的经典造模药物。线粒体通常被视为细胞动力源,线粒体损伤会对细胞功能产生重大影响,是正常衰老和血管重塑等发病的驱动因素。线粒体DNA聚合酶γ（mitochondrial DNA Polymerase gamma,POLG）是由Polg基因负责编码的,在组织中广泛表达,具有维持细胞功能完整性的重要功能。它位于线粒体,参与线粒体DNA复制与修复。POLG参与多种疾病的发生及发展,当POLG发生D257A点突变后会导致其核酸外切酶活性受损,导致线粒体DNA拷贝数异常及下降进而线粒体损伤。目前不清楚POLG在AngⅡ诱导的血管重塑中的作用及对血管重塑影响的潜在机制。线粒体STAT3存在于线粒体中,在调控线粒体功能方面起到关键的作用。目前认为STAT3可由Ser727位点磷酸化修饰形式进入线粒体。线粒体STAT3可以与线粒体DNA结合并调控线粒体基因表达,同时它还可以调节线粒体呼吸链的活性并影响ATP的生成等。目前尚不清楚线粒体STAT3与POLG在维持线粒体功能过程中是否存在相互作用,线粒体STAT3是否通过与POLG相互作用参与血管重塑过程等。本项研究旨在通过动物和细胞水平解析POLG在AngⅡ诱导的血管重塑过程中的作用,并进一步探究POLG调控血管重塑过程的潜在机制,为临床防治血管重塑提供新的思路。研究方法:第一部分:在小鼠中研究POLG在AngⅡ诱导的血管重塑中的作用。选用C57BL/6野生型（wild type,WT）及POLG点突变(在第257个氨基酸点突变,PolgD257A/D257A,简称D257A)小鼠,给予血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）皮下泵入2周,对照组给予生理盐水皮下泵入2周。期间每周检测小鼠血压情况,给药2周后用小动物超声仪检测小鼠主动脉重塑情况。留取主动脉标本（胸主动脉和腹主动脉）,采用H＆E染色观察血管壁厚度和管腔大小等,采用Masson染色观察血管纤维化程度。通过Western blot检测POLG在正常主动脉和血管重塑的主动脉的差异表达情况,表型转化标志蛋白（α-SMA和SM22α）及增殖迁移标志蛋白（PCNA、MMP9和MMP2）。第二部分:1.在人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic vascular smooth muscle cells,HAVSMCs）中构建AngⅡ诱导的平滑肌表型转化模型。首先我们将HAVSMCs分为四组,分别对其进行浓度梯度递增的AngⅡ处理,通过Western blot检测POLG表达情况,检测α-SMA和SM22α等评价平滑肌表型转化,通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架情况,通过CCK8实验等评价细胞活力,通过Transwell实验等评价细胞迁移能力。2.探讨过表达POLG对AngⅡ诱导的平滑肌表型转化等的影响。通过Western blot检测Myc及平滑肌表型转化标志蛋白等,通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架改变。通过CCK8实验、Transwell实验及Western blot检测增殖迁移标志蛋白来评估平滑肌细胞的增殖和迁移能力的改变。3.探讨敲减POLG对AngⅡ诱导的平滑肌表型转化等的影响。通过Western blot检测平滑肌表型转化标志蛋白等,通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架改变。4.探讨过表达突变型POLG对AngⅡ诱导的平滑肌表型转化等的影响。通过Western blot检测Myc及平滑肌表型转化标志蛋白等,通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架改变。第三部分:探究POLG调控血管重塑过程的潜在机制。1.首先我们通过D257A小鼠这一线粒体损伤模型,探讨了POLG对线粒体功能影响与血管重塑的关系。并通过免疫共沉淀实验检测动物水平正常情况及点突变的POLG与线粒体STAT3的结合情况。2.通过过表达不同状态POLG,探讨POLG对AngⅡ诱导的平滑肌表型转化等影响的可能机制。通过检测ATP含量及线粒体膜电位来评价线粒体功能变化。通过免疫共沉淀实验检测正常情况及AngⅡ处理后的内源POLG与线粒体STAT3的结合情况。3.探讨POLG与线粒体STAT3之间的作用关系。提取线粒体,检测线粒体中STAT3及其各种磷酸化形式的表达情况。在给予STAT3抑制剂的HAVSMCs过表达POLG,来判断过表达POLG能否挽救抑制STAT3对线粒体功能带来的影响,进而判断二者关系。结果:第一部分:在AngⅡ诱导的小鼠血管重塑中POLG表达降低。POLG发生D257A突变后暂未影响基础状态及AngⅡ诱导后的小鼠血压水平。给予AngⅡ刺激后D257A小鼠血管壁增厚更明显,管腔增大更明显,纤维化程度更重。给予AngⅡ刺激后D257A小鼠血管平滑肌表型转化相关的标志蛋白（α-SMA和SM22α）表达水平下降更明显,同时增殖迁移相关的标志蛋白（PCNA、MMP2和MMP9）表达水平升高更明显。第二部分:1.随着AngⅡ给药浓度的增加,POLG表达水平逐渐降低,HAVSMCs表型转化标志蛋白表达水平逐渐降低,增殖及迁移标志蛋白表达水平逐渐升高。随着药物浓度增加,细胞的骨架重排,肌丝分布越来越杂乱,细胞活力及迁移数量逐渐增加。2.在HAVSMCs中过表达POLG可以显著抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌表型转化相关的标志蛋白表达下降、细胞骨架重排及肌丝分布杂乱。同时,过表达POLG可以显著抑制AngⅡ诱导的增殖迁移相关的标志蛋白表达水平升高及细胞迁移数量的增加。3.在HAVSMCs中敲减POLG加重了AngⅡ诱导的血管平滑肌表型转化相关的标志蛋白表达下降、细胞骨架重排及肌丝分布杂乱。4.在HAVSMCs中过表达突变型POLG无法抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌表型转化相关的标志蛋白表达下降、细胞骨架重排及肌丝分布杂乱。第三部分:1.D257A小鼠血管平滑肌组织ATP生成减少,且自发出现血管平滑肌表型转化相关的标志蛋白表达水平下降,增殖迁移相关的标志蛋白表达水平升高,血管结构暂未发生明显异常。在小鼠主动脉平滑肌组织中,正常情况下POLG和线粒体STAT3存在结合,且在D257A点突变后结合减弱。2.在HAVSMCs中过表达野生型POLG可以抑制AngⅡ刺激引起的线粒体膜电位水平降低及ATP产生减少,而过表达突变型POLG无法起到上述抑制效果。在正常情况下POLG和线粒体STAT3存在结合,且在AngⅡ诱导的细胞损伤中结合增强。3.在线粒体中存在STAT3,且其主要磷酸化活性形式为p-STAT3 Ser727。给予STAT3抑制剂后加重AngⅡ引起的线粒体功能障碍,而过表达POLG挽救了STAT3抑制剂引起的线粒体功能障碍加重。结论:POLG抑制血管紧张素Ⅱ诱导的主动脉血管重塑。POLG发生异常后引起的线粒体损伤及功能障碍是导致血管重塑的原因之一。过表达野生型POLG而不是突变型POLG可以稳定线粒体功能从而抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌损伤。在稳定线粒体功能过程中,POLG是直接执行分子,线粒体STAT3起到辅助作用。在血管平滑肌细胞线粒体损伤时,POLG和STAT3形成复合物维持和修复线粒体损伤,而POLG突变后复合物形成减少不能维持线粒体功能,从而加重血管损伤。本研究阐述了POLG调控血管重塑及其分子机制,开辟了POLG功能研究的新方向,为临床防治血管重塑及相关疾病提供了新思路。