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猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染性疾病,该病对各个年龄阶段的猪均具有易感性,对三日龄以内的仔猪100%致死。近年来,我国乃至全球暴发的变异型PEDV疫情,对现有的养猪业造成巨大经济损失。PEDV为单股正链RNA(ssRNA)病毒,主要编码16种非结构蛋白和4种结构蛋白,其中核衣壳(Nucleocapsid)蛋白是病毒粒子中含量最多的蛋白,同时也是PEDV在细胞内复制的过程中所产生最多的结构蛋白,在病毒增殖的过程中发挥重要的作用。本实验室前期试验通过co-IP技术筛选出了一种与PEDV N蛋白互作的新型抗病毒蛋白-IRAV。为进一步探究IRAV对PEDV增殖的影响及其作用机制,本研究通过过表达及干扰试验确定IRAV对PEDV的影响,从分析PEDV感染宿主细胞后调控IRAV的转录因子及IRAV抑制PEDV增殖的分子机制两个方面入手,进行深入研究的结果如下:由于暂无猪源IRAV特异性抗体,本研究通过杂交瘤技术获得抗猪IRAV的单克隆抗体:首先,成功构建出猪源IRAV的原核表达载体,并于大肠杆菌中成功诱导表达出大小与预期相符的猪源IRAV蛋白;其次,将纯化后的IRAV蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,获得了5株分泌抗IRAV单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为为2B10、2G12、2H1、5A8和2C5;最后,通过Western-blot和间接免疫荧光试验分析,结果发现抗体与PK-15细胞中过表达的猪源IRAV蛋白发生特异性反应。综上所述,本研究成功制备出抗猪源IRAV蛋白的单克隆抗体,为深入开展后续试验奠定了基础。PEDV感染Vero或PK-15细胞后,荧光定量结果显示IRAV的表达量上调,通过扩增IRAV的启动子序列后,分析启动子结合位点,最终确定PEDV能够通过上调转录因子EGR1进而促进IRAV的表达。co-IP与共定位试验证实IRAV可以与PEDV N蛋白相互作用。探究二者的相互影响时发现:IRAV可以梯度降解N蛋白,经抑制剂处理及干扰降解通路中的关键分子后,IRAV对PEDV N蛋白的降解作用受到抑制。以上即证明:IRAV可以利用泛素化蛋白酶MARCH8泛素化N蛋白,进而通过自噬-溶酶体途径和泛素化途径最终降解PEDV N蛋白,发挥其抑制PEDV增殖的作用;除此之外,本研究还发现IRAV可以梯度降解其它冠状病毒N蛋白。为了进一步探讨宿主细胞利用IRAV抑制PEDV增殖的分子机制,我们通过co-IP和质谱测序技术筛选到TRIM21分子同样可以通过与PEDV N蛋白相互作用,利用泛素化-蛋白酶体途径对其进行降解,最终发挥抑制PEDV增殖的作用。综上所述:本研究从PEDV感染宿主细胞后调控IRAV的转录因子及IRAV和TRIM21对PEDV增殖的抑制作用两个方面入手,详细阐述了IRAV和TRIM21抑制PEDV增殖的作用机制,为防控PEDV提供了新的研究思路。