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甲状腺未分化癌（Anaplastic thyroid carcinoma,ATC）是侵袭性极强的一种恶性肿瘤,预后很差,一般确诊后的中位生存时间仅为5-6个月。虽然有患者长期生存的临床报道,但因为病理诊断的准确性常受到质疑。ATC尽管临床发病率低,约占甲状腺恶性肿瘤的1%-9%,但由于进展迅速,死亡率高,每年因甲状腺癌死亡的患者14%-50%为甲状腺未分化癌[1-3]。患者就诊的主要原因是颈部迅速增大的肿块,由于病情进展迅速患者就诊时往往已经是局部晚期,失去完整切除的机会,或者即使能够完整切除,但术后的快速复发及对放、化疗的不敏感性,导致患者的死亡率非常高。因此,了解甲状腺未分化癌发生发展及其对放化疗不敏感的分子机制,期望为ATC患者的治疗带来新的希望。研究报道,恶性肿瘤细胞和正常细胞在生长和代谢方面存在很大差异,很多肿瘤细胞的代谢模式都是基因重新编程的结果。线粒体是细胞的能量供应场所,通过有氧代谢产生能量为细胞供能,是进行三羧酸循环和氧化磷酸化中心,为细胞提供ATP。除给细胞供能,线粒体还是铁代谢和脂质氧化的中心[4],在氧化磷酸化的过程中产生活性氧[5-6],参与调控细胞的凋亡、炎性反应和衰老[7]。因此,维持线粒体功能的稳定才能维持细胞正常的生命活动。线粒体自噬是将细胞内损伤老化的线粒体消化分解为可再重新利用的物质并促进线粒体更新,保证细胞内线粒体的数量和质量的完整性,有利于细胞的生存,同样在肿瘤组织内,细胞也依赖线粒体自噬更新细胞内的线粒体,维持肿瘤细胞内环境的稳定性,与肿瘤的不良预后有相关性。线粒体外膜蛋白FUN14结构域包含蛋白-1（FUN14 domain containing 1,FUNDC1）,由155个氨基酸构成,是线粒体自噬受体蛋白,3次跨膜蛋白,定位于线粒体外膜,是一个高度保守蛋白。在低氧的环境下FUNDC1能够诱导线粒体自噬的发生,研究还发现FUNDC1表达的改变和蛋白翻译后的可逆磷酸化都能调控线粒体自噬水平的变化。FUNDC1在多种肿瘤组织内高表达,并通过上调细胞的线粒体自噬促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,但在甲状未分化癌中的作用现在尚不清楚。因此,本研究拟从以下三方面了解FUNDC1在甲状腺未分化癌内的作用。本研究从三个方面进行探索:第一部分,收集ATC患者的临床数据和标本,使用免疫组化（Immunohistochemical,IHC）、实时荧光定量聚合酶连锁反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和免疫印迹试验（Western Blot,WB）的方法检测癌和癌旁组织中FUNDC1的表达,结合患者的临床资料分析FUNDC1在ATC发生发展中作用。第二部分,成功构建了慢病毒FUNDC1敲减的ATC稳转细胞系,体外研究敲减FUNDC1后对细胞功能的影响。第三部分,通过基因芯片技术探索FUNDC1促进甲状腺未分化癌发生发展可能的分子生物学机制。最终论证FUNDC1在甲状腺未分化癌发生发展中的作用,以及做为潜在治疗靶点的可能,为下一步的基础研究和临床研究提供理论依据。第一部分FUNDC1在ATC中的表达及其与临床病理指标及预后的相关性分析目的:检测ATC和癌旁甲状腺组织中FUNDC1的表达,结合临床数据分析其在ATC中的作用。方法:1.通过IHC法,从79例ATC患者的样本中,取79例癌和40例癌旁组织进行FUNDC1蛋白表达的检测。2.取26对ATC患者的癌和癌旁组织标本,应用qRT-PCR进行FUNDC1 mRNA表达的检测,应用WB对3对标本进行蛋白表达的检测。3.结合相关临床病理资料分析免疫组化FUNDC1蛋白表达与甲状腺未分化癌患者临床病理特征之间的关系。结合患者的预后资料分析患者FUNDC1表达和患者预后指标之间的关系。结果1.免疫组化检测发现,与癌旁甲状腺组织相比,ATC中FUNDC1蛋白表达明显升高（P＜0.05）。2.qRT-PCR检测提示,与癌旁甲状腺组织相比,ATC中FUNDC1 mRNA的表达明显升高（P＜0.05）,WB检测提示ATC组织FUNDC1蛋白的表达高于癌旁组织。3.分析FUNDC1的蛋白表达和临床病理特征之间的关系提示FUNDC1的高表达与肿瘤的T分期、淋巴结转移和TNM分期有显著相关性（P＜0.05）。4.在无病生存分析和生存分析中发现,FUNDC1高表达患者的无病生存期（Disease free survival,DFS）及总生存期（Overall survival,OS）更短,提示 FUNDC1可以作为预测甲状腺未分化癌的独立预后因素,有促进肿瘤进展、复发的作用（P＜0.05）。第二部分 体外FUNDC1基因敲减后对ATC细胞功能的影响目的:构建慢病毒敲减FUNDC1的稳转ATC细胞系,研究FUNDC1对细胞功能影响。方法:1.检测ATC细胞系8305C和CAL-62中FUNDC1表达的丰度。2.选择FUNDC1表达丰度更高的ATC细胞系进行后续的实验。3.构建慢病毒敲减FUNDC1的稳定转染ATC细胞系。4.应用WB和qRT-PCR方法验证shRNAi干扰的效果。5.克隆形成实验和MTT法检测FUNDC1表达下调后ATC细胞的增殖能力,流式细胞仪检测FUNDC1表达下调后ATC细胞的凋亡状态;侵袭实验检测FUNDC1表达下调后ATC细胞的侵袭能力;划痕实验检测细胞FUNDC1表达下调后ATC细胞的迁移能力;Transwell法检测细胞FUNDC1表达下调后对ATC细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:1.qRT-PCR检测发现,FUNDC1在两个ATC细胞系中稳定表达,表达丰度较高,其中CAL-62表达丰度更高。2.慢病毒转染后,FUNDC1的mRNA及蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。3.在抑制FUNDC1的表达后,细胞的凋亡率上升,细胞的增殖能力下降,细胞的侵袭和转移能力明显下降（P＜0.05）。第三部分 FUNDC1对ATC生物学功能的分子生物学机制研究目的:运用基因芯片技术,探索FUNDC1在促进ATC发生发展过程中可能的分子机制,探索FUNDC1蛋白作为ATC肿瘤治疗或肿瘤辅助治疗的潜在靶点的可能性,为后续的基础和临床研究提供相关理论基础。方法:1.应用基因芯片技术检测FUNDC1敲减后ATC细胞基因谱的差异表达。2.利用生物信息学软件（Ingenuity pathway analysis,IPA）分析差异表达的基因探索FUNDC1促进甲状腺未分化癌发生发展的信号通路及功能机制。结果:1.RNA表达谱芯片检测发现,FUNDC1通过激活Sumoylation信号通路参与了肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell,CSC）干性的维持和肿瘤细胞的上皮间充质化,从而促进了肿瘤细胞的高侵袭性、转移,并参与了肿瘤的复发及肿瘤细胞对化疗的抵抗（P＜0.05）。2.FUNDC1通过激活Sprouting,促进肿瘤组织脉管的形成,与肿瘤组织的侵袭、转移密切相关,而抑制Quantity of reactive oxygen species,避免细胞内过氧化物的聚集,抑制细胞氧化应激损伤导致的细胞凋亡并参与调控了细胞的转移和侵袭（P＜0.05）。全文结论:1.ATC中的FUNDC1表达明显高于癌旁甲状腺组织,其高表达与肿瘤的T分期、淋巴结转移和TNM分期显著相关,另外FUNDC1高表达患者的无病生存期及总生存期更短,提示患者预后不良,可以作为影响患者预后的独立危险因素。2.在敲减ATC细胞中FUNDC1的表达后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降,细胞凋亡率升高。3.RNA基因芯片检测发现,FUNDC1通过上调细胞的SUMO化、减少细胞内活性氧类物质（Reactive Oxygen Species,ROS）的蓄积、促进脉管系统的发生发展参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡,参与维持肿瘤干细胞干性和肿瘤细胞的上皮间充质化,可能与肿瘤的复发和肿瘤细胞的化疗抵抗相关。