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黄河是中国第二大河，也是世界上含沙量最大的河流，其携带的泥沙中有30％-40％淤积在河口并逐步向海洋方向延伸，逐渐形成了黄河三角洲近海河口湿地。近海河口湿地是海洋生态系统、河流生态系统和陆地生态系统的交汇区，具有重要的生态功能。黄河三角洲湿地微生物的研究对湿地的高效治理和稳定发展至关重要，与黄河流域的生态保护和高质量发展密切相关。在本论文中，我们以黄河三角洲湿地为研究对象，利用16SrRNA基因扩增子测序、宏基因组测序、宏转录组测序和非靶向代谢组等技术手段，研究了黄河三角洲湿地土壤微生物组成和生态功能随植被定植的变化，然后分析了黄河河口过渡区浮游细菌和底栖细菌群落构建、来源性及环境适应性随盐度剧烈变化的响应，研究结果将揭示黄河三角洲湿地环境因子缓慢变化和剧烈变化两种情况下微生物组成和生态功能的变化和规律。
我们首先于2017年12月在黄河三角洲湿地沿着逐渐远离海洋的方向，采集了不同植被定植地(即无植被定植的裸地、稀疏翅碱蓬(Suaedasalsa)定植地、茂密翅碱蓬定植地和茂密芦苇(Phragmitesaustralis)定植地)的土壤样品。16SrRNA基因扩增子测序分析发现，随着植被的定植，土壤细菌多样性和丰富度逐渐提高。主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)和聚类分析显示，裸地样品单独聚类成一组，而不同植被地样品聚类成另一组，这说明裸地土壤中细菌群落结构显著区别于各类型植被定植地，裸地和植被地土壤细菌群落之间为“跳跃式”变化，而不同植被定植地土壤细菌群落之间则是“渐变式”变化。进一步的物种注释分析发现裸地具有高丰度的“单种(monospecies)”蓝细菌(Cyanobacteria)，其中丰度最高的属为某未知蓝细菌属，其丰度占细菌总丰度的17.98％(其中单个蓝细菌OTU占总丰度的13.27％)，而植被地则普遍具有高丰度的“多种(multispecies)”芽单胞菌(Gemmatimonadetes)，丰度最高的属为某未知芽单胞菌属，其在不同的植被地土壤中的丰度在8.21％-10.58％之间。这些结果说明，裸地和植被地土壤中优势细菌的种类和组成模式都显著不同。物种组成与环境因子关联分析表明，在我们分析的9种环境因子中，pH、土壤含水量和盐度对湿地土壤细菌群落组成的贡献最大。一般而言，群落的物种组成决定着群落的生态功能，因此我们进一步利用土壤宏转录组测序分析了裸地和植被地土壤微生物的生态功能的差异。分析结果表明，裸地中光合作用相关基因明显高表达，这与其高丰度的蓝细菌相对应。而植被地中则是有机质代谢(如嘌呤代谢、丙酮酸代谢以及烟酸和烟酰胺代谢等)和主要元素(如碳、氮、硫和磷)循环相关基因上调表达，同时这些植被地中高表达的基因也可在从宏基因组序列中利用binning获得的芽单胞菌的基因组(ydcontigbins.4)中鉴定到。此外，我们还利用非靶向代谢组从不同类型土壤提取液中鉴定到一系列与宏转录组中高表达基因相对应的关键化合物(如与嘌呤代谢有关的环化鸟嘌呤苷酸(2，3-cyclicGMP)，与烟酸和烟酰胺代谢有关葫芦巴碱(Trigonelline))。这些结果说明，可进行光合固碳的蓝细菌在无植被定植的贫瘠裸地中起着重要的碳汇作用，而芽单胞菌在各类植被地的主要元素循环等方面起着至关重要的作用。土壤微生物的生态功能是湿地生态功能的重要组成，植被定植是黄河三角洲滨海湿地土壤微生物群落结构和生态功能变化的决定因素。
其后，我们于2019年夏季(5月)和冬季(11月)在黄河入海口附近，采集了跨越黄河到海洋的162个水体和沉积物样品。其中水体样品的盐度变化范围为0.5PSU(practical salinity unit，‰)到30.1PSU，沉积物样品的盐度变化范围为0.4g/kg到16.5g/kg。我们将水体样品先后利用孔径为3.0μm和0.22μm的滤膜收集颗粒吸附类(particle-associated，PA)和自由生活类(free-living，FL)的浮游细菌。16SrRNA基因扩增子测序分析显示，沉积物中的底栖细菌(sediment，S)丰富度和多样性显著高于水体中的浮游细菌PA(p＜0.05)，而后者又显著高于浮游细菌FL(p＜0.05)，但同一环境类型(PA、FL或S)的细菌丰富度和多样性在夏季和冬季之间没有显著差异(p＞0.05)。PCoA和聚类分析结果显示沉积物样品自成一组且与盐度变化无明显的对应关系，而水体中的浮游细菌则随盐度的变化呈现出明显的分组(淡水区、半咸水区和海洋区)。另外，典型对应分析(canonical correspondence analysis，CCA)显示，盐度对夏季/冬季PA、FL和S细菌群落结构差异的贡献度分别为34.2％/43.7％、39.3％/37％和10.1％/8.6％，这些值远高于其他环境因子(包括总有机碳，总氮和pH)。Mantel检验还发现与底栖细菌相比，浮游细菌群落组成的差异与盐度变化的关系更密切(夏季/冬季PA和FL∶Pearsonsr=0.8978/0.9360和0.9273/0.8740，p＜0.01;夏季/冬季S∶Pearsonsr=0.5805/0.5777，p＜0.05)。物种注释分析显示底栖细菌和浮游细菌的物种组成存在明显差异，它们各自的优势类群随盐度变化呈现出不同的丰度变化模式，浮游细菌某些优势类群随盐度变化呈现出明显消亡或繁盛，而底栖细菌优势类群这种现象则很不明显。朔源分析结果显示冬季浮游细菌极少来自夏季浮游细菌，但冬季底栖细菌有65.19％来自夏季底栖细菌。过渡区半咸水中浮游细菌主要来自海洋浮游细菌且这一结果得到实验室人工模拟实验的验证，而过渡区沉积物中底栖细菌则是海洋沉积物和淡水沉积物底栖细菌的混合。零模型分析结果表明沉积物中的底栖细菌的群落构建以确定性过程为主，同质选择是其细菌群落构建最重要的生态过程，解释了群落差异的72.08％(夏季)和82.91％(冬季)，其次是扩散限制，它们几乎不受盐度变化的影响。而水体中浮游细菌的群落构建以随机过程为主，且它们的主要生态过程随盐度变化而明显变化，淡水区以同质选择为主，海水区以生态漂变为主。这些结果说明，在我们分析的环境因子中，盐度是影响黄河河口区细菌组成和变化最重要的环境因子，且水体中的浮游细菌比沉积物中的底栖细菌更易受盐度变化的影响。
为了进一步分析黄河河口过渡区浮游细菌和底栖细菌的生态功能和环境适应性，我们选择黄河河口过渡区代表性样品进行了宏基因组(夏季9个样点的9份S、9份PA和9份FL)和宏转录组(夏季盐度变化最剧烈的水体样品，包括4份PA和4份FL)测序分析。我们利用宏基因组分析了不同环境类型中(S、PA和FL)与碳元素、硫元素和氮元素循环直接相关的代谢过程丰度(代谢潜力)随盐度的变化规律，结果显示有氧呼吸(aerobic respiration)、氮同化(nitrogen assimilation)和硫矿化(sulfur mineralization)分别在碳元素、硫元素和氮元素循环过程中具有最高的占比，分别达到了55.60％、50.09％和70.83％。值得一提的是，上述三个代谢过程的相对丰度均是在浮游细菌FL中最高。此外，我们利用宏基因组binning技术获得了274个高质量非冗余的MAGs，其中包括168个变形菌门(Proteobacteria)，55个放线菌门(Actinobacteria)和36个拟杆菌门(Bacteroidetes)。宏转录组显示细菌渗透压调节相关基因在浮游细菌FL中比在浮游细菌PA具有更高的表达活性，且这些基因在半咸水中表达活性最高，这说明无论细菌从淡水进入半咸水或者从海水进入半咸水，这种胞外渗透压的快速变化均致使浮游细菌FL中渗透压调节相关基因高表达。这些结果说明，浮游细菌FL、浮游细菌PA和底栖细菌具有显著不同的主要元素代谢潜力。随着盐度变化，浮游细菌FL比浮游细菌PA具有更明显的响应，特别是细菌渗透压调节相关基因的表达。总之，我们揭示了淡水河入海这一重大自然过程中，浮游细菌FL，浮游细菌PA和底栖细菌面对盐度的变化，在群落构建、来源性、优势类群丰度变化以及环境适应性等多方面呈现出显著不同的响应模式。
在本论文中，我们选择环境因子变化剧烈的黄河三角洲近海河口湿地为研究对象，首先分析了土壤细菌随植被定植的变化，揭示了植被定植对湿地土壤微生物组成和生态功能的决定性作用;之后研究了水体中浮游细菌和沉积物中底栖细菌在黄河入海过程中随盐度变化的不同响应，发现浮游细菌和底栖细菌在群落构建、群落组成、来源性和环境适应性等诸多方面存在明显的差异。我们的研究结果提高了人们对黄河三角洲相关微生物的认识，为黄河三角洲甚至黄河流域的生态保护和高质量发展提供理论指导。
我们首先于2017年12月在黄河三角洲湿地沿着逐渐远离海洋的方向，采集了不同植被定植地(即无植被定植的裸地、稀疏翅碱蓬(Suaedasalsa)定植地、茂密翅碱蓬定植地和茂密芦苇(Phragmitesaustralis)定植地)的土壤样品。16SrRNA基因扩增子测序分析发现，随着植被的定植，土壤细菌多样性和丰富度逐渐提高。主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)和聚类分析显示，裸地样品单独聚类成一组，而不同植被地样品聚类成另一组，这说明裸地土壤中细菌群落结构显著区别于各类型植被定植地，裸地和植被地土壤细菌群落之间为“跳跃式”变化，而不同植被定植地土壤细菌群落之间则是“渐变式”变化。进一步的物种注释分析发现裸地具有高丰度的“单种(monospecies)”蓝细菌(Cyanobacteria)，其中丰度最高的属为某未知蓝细菌属，其丰度占细菌总丰度的17.98％(其中单个蓝细菌OTU占总丰度的13.27％)，而植被地则普遍具有高丰度的“多种(multispecies)”芽单胞菌(Gemmatimonadetes)，丰度最高的属为某未知芽单胞菌属，其在不同的植被地土壤中的丰度在8.21％-10.58％之间。这些结果说明，裸地和植被地土壤中优势细菌的种类和组成模式都显著不同。物种组成与环境因子关联分析表明，在我们分析的9种环境因子中，pH、土壤含水量和盐度对湿地土壤细菌群落组成的贡献最大。一般而言，群落的物种组成决定着群落的生态功能，因此我们进一步利用土壤宏转录组测序分析了裸地和植被地土壤微生物的生态功能的差异。分析结果表明，裸地中光合作用相关基因明显高表达，这与其高丰度的蓝细菌相对应。而植被地中则是有机质代谢(如嘌呤代谢、丙酮酸代谢以及烟酸和烟酰胺代谢等)和主要元素(如碳、氮、硫和磷)循环相关基因上调表达，同时这些植被地中高表达的基因也可在从宏基因组序列中利用binning获得的芽单胞菌的基因组(ydcontigbins.4)中鉴定到。此外，我们还利用非靶向代谢组从不同类型土壤提取液中鉴定到一系列与宏转录组中高表达基因相对应的关键化合物(如与嘌呤代谢有关的环化鸟嘌呤苷酸(2，3-cyclicGMP)，与烟酸和烟酰胺代谢有关葫芦巴碱(Trigonelline))。这些结果说明，可进行光合固碳的蓝细菌在无植被定植的贫瘠裸地中起着重要的碳汇作用，而芽单胞菌在各类植被地的主要元素循环等方面起着至关重要的作用。土壤微生物的生态功能是湿地生态功能的重要组成，植被定植是黄河三角洲滨海湿地土壤微生物群落结构和生态功能变化的决定因素。
其后，我们于2019年夏季(5月)和冬季(11月)在黄河入海口附近，采集了跨越黄河到海洋的162个水体和沉积物样品。其中水体样品的盐度变化范围为0.5PSU(practical salinity unit，‰)到30.1PSU，沉积物样品的盐度变化范围为0.4g/kg到16.5g/kg。我们将水体样品先后利用孔径为3.0μm和0.22μm的滤膜收集颗粒吸附类(particle-associated，PA)和自由生活类(free-living，FL)的浮游细菌。16SrRNA基因扩增子测序分析显示，沉积物中的底栖细菌(sediment，S)丰富度和多样性显著高于水体中的浮游细菌PA(p＜0.05)，而后者又显著高于浮游细菌FL(p＜0.05)，但同一环境类型(PA、FL或S)的细菌丰富度和多样性在夏季和冬季之间没有显著差异(p＞0.05)。PCoA和聚类分析结果显示沉积物样品自成一组且与盐度变化无明显的对应关系，而水体中的浮游细菌则随盐度的变化呈现出明显的分组(淡水区、半咸水区和海洋区)。另外，典型对应分析(canonical correspondence analysis，CCA)显示，盐度对夏季/冬季PA、FL和S细菌群落结构差异的贡献度分别为34.2％/43.7％、39.3％/37％和10.1％/8.6％，这些值远高于其他环境因子(包括总有机碳，总氮和pH)。Mantel检验还发现与底栖细菌相比，浮游细菌群落组成的差异与盐度变化的关系更密切(夏季/冬季PA和FL∶Pearsonsr=0.8978/0.9360和0.9273/0.8740，p＜0.01;夏季/冬季S∶Pearsonsr=0.5805/0.5777，p＜0.05)。物种注释分析显示底栖细菌和浮游细菌的物种组成存在明显差异，它们各自的优势类群随盐度变化呈现出不同的丰度变化模式，浮游细菌某些优势类群随盐度变化呈现出明显消亡或繁盛，而底栖细菌优势类群这种现象则很不明显。朔源分析结果显示冬季浮游细菌极少来自夏季浮游细菌，但冬季底栖细菌有65.19％来自夏季底栖细菌。过渡区半咸水中浮游细菌主要来自海洋浮游细菌且这一结果得到实验室人工模拟实验的验证，而过渡区沉积物中底栖细菌则是海洋沉积物和淡水沉积物底栖细菌的混合。零模型分析结果表明沉积物中的底栖细菌的群落构建以确定性过程为主，同质选择是其细菌群落构建最重要的生态过程，解释了群落差异的72.08％(夏季)和82.91％(冬季)，其次是扩散限制，它们几乎不受盐度变化的影响。而水体中浮游细菌的群落构建以随机过程为主，且它们的主要生态过程随盐度变化而明显变化，淡水区以同质选择为主，海水区以生态漂变为主。这些结果说明，在我们分析的环境因子中，盐度是影响黄河河口区细菌组成和变化最重要的环境因子，且水体中的浮游细菌比沉积物中的底栖细菌更易受盐度变化的影响。
为了进一步分析黄河河口过渡区浮游细菌和底栖细菌的生态功能和环境适应性，我们选择黄河河口过渡区代表性样品进行了宏基因组(夏季9个样点的9份S、9份PA和9份FL)和宏转录组(夏季盐度变化最剧烈的水体样品，包括4份PA和4份FL)测序分析。我们利用宏基因组分析了不同环境类型中(S、PA和FL)与碳元素、硫元素和氮元素循环直接相关的代谢过程丰度(代谢潜力)随盐度的变化规律，结果显示有氧呼吸(aerobic respiration)、氮同化(nitrogen assimilation)和硫矿化(sulfur mineralization)分别在碳元素、硫元素和氮元素循环过程中具有最高的占比，分别达到了55.60％、50.09％和70.83％。值得一提的是，上述三个代谢过程的相对丰度均是在浮游细菌FL中最高。此外，我们利用宏基因组binning技术获得了274个高质量非冗余的MAGs，其中包括168个变形菌门(Proteobacteria)，55个放线菌门(Actinobacteria)和36个拟杆菌门(Bacteroidetes)。宏转录组显示细菌渗透压调节相关基因在浮游细菌FL中比在浮游细菌PA具有更高的表达活性，且这些基因在半咸水中表达活性最高，这说明无论细菌从淡水进入半咸水或者从海水进入半咸水，这种胞外渗透压的快速变化均致使浮游细菌FL中渗透压调节相关基因高表达。这些结果说明，浮游细菌FL、浮游细菌PA和底栖细菌具有显著不同的主要元素代谢潜力。随着盐度变化，浮游细菌FL比浮游细菌PA具有更明显的响应，特别是细菌渗透压调节相关基因的表达。总之，我们揭示了淡水河入海这一重大自然过程中，浮游细菌FL，浮游细菌PA和底栖细菌面对盐度的变化，在群落构建、来源性、优势类群丰度变化以及环境适应性等多方面呈现出显著不同的响应模式。
在本论文中，我们选择环境因子变化剧烈的黄河三角洲近海河口湿地为研究对象，首先分析了土壤细菌随植被定植的变化，揭示了植被定植对湿地土壤微生物组成和生态功能的决定性作用;之后研究了水体中浮游细菌和沉积物中底栖细菌在黄河入海过程中随盐度变化的不同响应，发现浮游细菌和底栖细菌在群落构建、群落组成、来源性和环境适应性等诸多方面存在明显的差异。我们的研究结果提高了人们对黄河三角洲相关微生物的认识，为黄河三角洲甚至黄河流域的生态保护和高质量发展提供理论指导。