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人参属(Panax)植物均具有较高的药用价值,其主要活性成分是皂苷。竹节人参(P.japonicus)根中的总皂苷含量高达15%以上,约为人参(P.ginseng)的2～7倍、西洋参(P.quinguefolium)的3倍,是总皂苷含量最高的人参属植物。人参皂苷属于三萜皂苷,是由角鲨烯通过不同方式环合形成的,β-香树脂醇合成酶(βaS)和达玛烯二醇合成酶(DS)是人参皂苷生物合成途径的限速酶。本研究采用RT-PCR和SMART-RACE技术,首次从竹节人参的根中克隆出βAS和DS基因的全长cDNA,并进行了两个基因的序列分析、功能预测和原核表达;对目的基因序列进行了优化设计,构建了目的基因的双T-DNA植物表达载体,遗传转化到水稻“台粳9号”和“蜀恢527”中,并对转基因水稻进行了检测分析,创制出含有皂苷功能成分的原创性的“人参稻”新种质。主要的研究结果如下:1.克隆出βAS基因并进行同源性比较:首次从竹节人参的根中克隆获得βMS基因的全长cDNA,命名为PjβAS,全长2715bp,包含一个完整的开放阅读框(2286bp),编码761个氨基酸,其蛋白分子量约为87.8kDa。在核苷酸水平上,竹节人参βAS基因全长cDNA与高丽参βAS2基因及辽东楤木、白桦、苹果的βAS基因分别有96%、83%、81%、80%的同源性;在氨基酸水平上,竹节人参βAS与高丽参βAS2及辽东楤木、白桦、苹果的βAS分别有98%、86%、85%、83%的相同性和98%、91%、92%、91%的相似性。2.克隆出DS基因并进行同源性比较:首次克隆获得竹节人参DS基因的全长cDNA,命名为PjDS,全长2572bp,包含一个完整的开放阅读框(2310bp),编码769个氨基酸,其蛋白分子量约为88.2kDa。在核苷酸水平上,竹节人参DS基因全长cDNA与高丽参、西洋参、三七的DS基因及高丽参的βAS基因(AB 122080.1)分别有98%、98%、97%、97%的同源性;在氨基酸水平上,竹节人参DS与高丽参、西洋参、三七的DS分别有99%、99%、98%的相同性和99%、100%、99%的相似性。3.预测目的基因的功能并进行原核表达:CDD和CDART数据库搜索结果表明,竹节人参βAS和DS与其它植物一样都具有Ⅱ型萜烯环化酶和蛋白异戊烯转移酶β亚基的保守结构域;blocks数据库搜索结果表明,竹节人参βAS和DS与其它植物一样都具有萜烯合成酶家族的6个功能结构域和异戊烯转移酶/角鲨烯环化酶家族的功能结构域。因此,推测PjβAS和PjDS分别具有片香树脂醇合成酶基因和达玛烯二醇合成酶基因的功能。分别构建了PjβAS和PjDS的原核表达载体pET-AS和pET-DS,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,两个目的基因均成功表达出与预期大小一致的融合蛋白。4.优化设计目的基因序列并进行全基因合成:根据水稻的密码子偏爱性,分别对βAS和DS基因的编码区序列进行密码子优化;并在目的基因的5’端添加谷蛋白基因的信号肽序列,在3’端添加内质网滞留信号序列。优化设计后的βAS和DS基因分别命名为SPAS(2382bp)、SPDS(2406bp),并进行了人工合成。在优化设计的目的基因序列中,水稻使用频率不足10%的稀有密码子使用次数显著减少,水稻偏爱的密码子使用次数均显著增加。5.构建目的基因的双T-DNA植物表达载体并遗传转化水稻:分别构建了SPAS、OPAS、βAS原序列和SPDS基因的双T-DNA植物表达载体pCDMAR-SPAS-hpt、pCDMAR-OPAS-hpt、pCDMAR-AS-hpt、pCDMAR-SPDS-hpt,其中OPAS基因两端不含谷蛋白基因信号肽序列和内质网滞留信号序列。采用农杆菌介导法,将四个植物表达载体分别转化到水稻品种“台粳9号”或“蜀恢 527”中。6.转基因水稻的获得及其检测分析:(1)转基因水稻的PCR鉴定:潮霉素抗性基因HPT的PCR扩增结果表明,上述所有抗性水稻植株均含有HPT基因。目的基因的PCR扩增结果表明:SPAS基因转化“台粳9号”获得的阳性植株为38株,阳性率为58.5%;OPAS因转化“台粳9号”获得的阳性植株为14株,阳性率为24.6%;βS基因转化“台粳9号”和“蜀恢527”获得的阳性植株分别为12株和5株,阳性率分别为16.4%和11.4%;SPDS基因转化“台粳9号”和“蜀恢527”获得的阳性植株均为10株,阳性率分别为13.7%、15.6%。(2)T-DNA区插入位点的hiTAIL-PCR分析:通过对部分阳性水稻植株进行hiTAIL-PCR,扩增转基因水稻中目的基因插入位点的侧翼基因组序列,结果表明:SPAS和SPDS等基因已分别整合到水稻品种“台粳9号”或“蜀恢527”的基因组中,阳性植株SA30、SA37、SA43、7D6、7D22、7D24和7D36均获得了 T-DNA区插入位点的侧翼水稻基因组序列。将获得的侧翼序列与水稻品种“9311”或“日本晴”的基因组序列进行同源比对和BLAST搜索,结果表明:SPAS在植株SA30中的插入位点为第5染色体的9309.76kb,在植株SA37中的插入位点为第12染色体的5301.91kb,在植株SA43中的插入位点为第2染色体的 31969.15kb 和 31972.45kb;SPDS在转基因植株 7D6、7D22、7D24、7D36 中的插入位点均为第3染色体的31741.45kb。(3)转基因水稻中目的基因表达水平的qRT-PCR分析:在转基因水稻中,目的基因的相对表达量(RQ)口下::SPAS为2658.8～13915.9,OPAS为320.3～1544.9,βAS为3329.1～17777.4,SPDS为5589.2～6399.7(阴性植株的表达量均设定为1)。从中可以看出:①OPAS基因的表达量显著低于βAS基因,而SPAS基因的表达量与;βAS基因较为接近。这说明βAS基因编码区的密码子优化未能提高该基因在转基因水稻中的表达量,反而使表达量显著降低;非编码区的优化设计(添加谷蛋白基因信号肽序列和内质网滞留信号序列)使βAS基因在转基因水稻中的表达量得到显著提高。②SPDS基因在不同转基因植株间的表达量差异不大。(4)转基因水稻中目的蛋白的Western blot检测:竹节人参βAS基因和DS基因分别在转基因水稻植株中成功表达出β-香树脂醇合成酶和达玛烯二醇合成酶,分子量约为88kDa,与预期大小一致,而阴性植株均未检测到任何条带。(5)转基因水稻中皂苷元含量的HPLC检测:采用回流提取法,从部分转基因植株的叶片中分别提取皂苷元20(S)-原人参二醇(PPD)、20(S)-原人参三醇(PPT)和齐墩果酸(Ole),HPLC检测结果表明:转SPDS基因的水稻植株中,除了 7D34外均能检测到目标产物PPD和PPT,PPD的含量为0.06‰～0.20‰,PPT的含量为0.00‰～1.73‰(7D34的PPT含量为0);转SPAS、OPAS、βAS基因的水稻植株中,仅有少数植株能检测到目标产物Ole,含量仅为0.011‰～0.13‰,除AS60外,有检测到的植株中Ole含量均小于0.10‰。