研究背景新型冠状病毒肺炎疫情自暴发以来,持续两年有余,现仍在世界范围内快速传播。新冠肺炎给世界人民的生命健康和国际经济发展造成了不可估量的损失。几千年来,中医药学者在与疫病的百余次交锋中积累了大量的用药经验,制定出许多行之有效的方药,为中医药防治新冠肺炎奠定了坚实的理论与实践基础。中医药在新冠肺炎疫情防控上发挥了重要作用,中西医结合治疗手段可以显著提高患者的治愈率。喜炎平注射液的成分为穿心莲内酯总磺化物。穿心莲提取物穿心莲内酯经一系列工艺加工制备成穿心莲内酯总磺化物,显著增强穿心莲内酯生物利用度的同时,又保留了其清热解毒、燥湿、抗炎等多种药理活性。苏合香丸最早被记载于宋代《太平惠民和剂局方》中,由苏合香、安息香、丁香、香附等15味中药组成,具有行气止痛,开窍醒神之效,主要治疗中风、休克等心脑血管疾病,是急救常用的中成药之一。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中推荐喜炎平注射液和苏合香丸治疗新冠肺炎重型和危重型患者。由于中药及其复方具有多成分,多靶点,多途径整体协同发挥治疗作用的特点,故而本研究从系统生物网络的角度探索喜炎平注射液和苏合香丸治疗新冠肺炎的作用机制。研究目的本研究在中医药理论和整合大数据理念指导下,采用生物信息学方法寻找影响新冠肺炎疾病发生、发展的潜在关键基因;应用网络药理学、分子对接、分子生物学实验的方法,从系统生物网络的角度,探究苏合香丸和喜炎平注射液治疗新冠肺炎的分子机制。希冀为更深入地揭示两种中成药治疗新冠肺炎作用机制提供参考,同时为临床合理使用两种中成药治疗新冠肺炎提供依据。研究方法1.生物信息学分析在GEO数据库中收集符合筛选条件的新冠肺炎数据集,应用R 3.6.1软件中的limma包获取差异表达基因。通过STRING数据库得到差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用数据,将获得的数据导入Cytoscape 3.7.1软件中构建蛋白互作网络图。采用Cytoscape中的MCODE、CytoHubba插件进行模块分析和关键基因筛选。应用R软件中的clusterProfiler包对差异基因和核心模块进行GO和KEGG富集分析。根据Pearson相关系数,使用R中的corrplot包进行基因相关性分析。2.网络药理学和分子对接分析通过查找TCMSP、BATMAN-TCM、PubMed、CNKI数据库,收集苏合香丸和喜炎平注射液中的化学成分。在TCMSP、BATMAN-TCM数据库中直接收集化合物靶点,随后使用UniProt数据库将蛋白名称转化为基因名。同时,将化学成分导入PubChem数据库,获得化学成分SMILES结构信息,将SMILES结构导入Swiss Target Prediction数据库中获取化合物的靶点。通过GeneCards、TTD、OMIM、GEO数据库收集新冠肺炎的靶点。将化合物靶点和疾病靶点取交集,获得苏合香丸和喜炎平注射液治疗新冠肺炎的潜在治疗靶点。再将潜在治疗靶点输入到STRING数据库中进一步分析,利用Cytoscape软件构建蛋白互作网络。通过MCODE、CytoHubba等插件对蛋白互作网络进行模块分析和关键基因的筛选。使用R软件和DAVID数据库对蛋白互作网络和关键模块靶点进行GO和KEGG富集分析。使用Autodock Tools软件对核心靶点与重要化合物进行分子对接验证。从PDB数据库中下载大分子蛋白的pdb格式文件,经过除水、小分子、加氢、加电荷等处理,保存为pdbqt格式文件。从PubChem数据库中下载小分子化合物结构,通过ChemDraw软件将其转化成mol2格式文件,进行添加电荷操作后,保存为pdbqt格式文件。随后在Autodock软件中确定对接盒子的大小和位置。使用Autodock Vina进行化合物与其对应靶点的对接结合能运算。最后利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理。3.分子生物学分析首先利用CCK-8实验探究喜炎平注射液对人肺上皮细胞增殖的影响,以获取安全给药浓度范围。采用PolyI:C诱导人肺上皮细胞造成炎症模型,随后应用ELISA法、RT-qPCR法、Western Blot法检测喜炎平注射液对重要基因表达的影响。研究结果1.基于生物信息学的新冠肺炎潜在关键基因研究从GEO数据库中下载新冠肺炎芯片数据集:GSE164805。对该芯片数据集进行分析,共筛选出新冠肺炎重型患者和健康人差异基因3840个,其中表达上调的有1671个,下调的2169个;轻型患者和健康人的差异基因共2375个,其中表达上调的有1123个,下调的有1252个。随后,通过富集分析、蛋白互作网络构建和分析、模块分析、基因表达水平和基因相关性分析,最终得到TNF、RELA、CXCL1、RPSA、UBA52等9个可能与新冠肺炎发生、发展相关的潜在关键基因。GO富集分析结果显示,关键基因主要和对细胞因子的反应、细胞对细胞因子刺激的反应、酶结合等生物学过程有关。KEGG富集分析结果显示,关键基因多富集在NF-κB信号通路、冠状病毒病-新冠肺炎信号通路。2.基于网络药理学的苏合香丸治疗新冠肺炎机制研究通过构建蛋白互作网络和网络分析、富集分析、分子对接验证,共得到4个核心靶点分别是IL-6、IL-10、VEGFA、TNF,这些靶点与重要化合物槲皮素、山奈酚、木犀草素、胡椒碱、芝麻素之间具有良好的结合亲和力。同时ACE2和3CLpro这两个公认的新冠肺炎靶点与槲皮素、山奈酚亦有较好的结合能力。GO富集分析结果显示,核心靶点主要富集在免疫系统过程的正向调节、对刺激反应的调节、对细胞因子的应答、生长因子结合等生物过程中。KEGG富集分析结果表明,核心靶点主要富集在JAK-STAT信号通路,PI3K-Akt信号通路,C型凝集素受体信号通路,HIF-1信号通路等通路中。3.基于网络药理学的喜炎平注射液治疗新冠肺炎机制研究共收集得到7个喜炎平注射液中的活性成分,其中17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠可以被认为是最核心的活性成分。通过网络分析、关键靶点筛选和分子对接,得到 IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8、STAT3、MAPK1、MAPK14、MAPK8 共 8 个核心靶点。17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠与核心靶点及ACE2和3CLpro之间均具有较好的结合能力。GO富集分析结果表明,核心靶点主要富集在细胞因子产生的正调控、炎症反应、免疫反应等生物过程。KEGG富集分析结果表明,喜炎平注射液通过调控Toll样受体信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路等多条信号通路发挥治疗新冠肺炎的作用。4.喜炎平注射液对人肺上皮细胞炎症模型的药效作用机制研究实验结果表明,喜炎平注射液在500μg/mL浓度范围内对人肺上皮细胞无毒性。通过ELISA、RT-qPCR、Western Blot实验,证实了该注射液可以显著下调PolyI:C诱导的人肺上皮细胞造成的炎症模型中IL-6、TNF-α、IL-1β、CXCL8和p-STAT3的表达。进一步验证喜炎平注射液可能通过抑制细胞因子风暴,来抑制过度免疫反应,从而治疗新冠肺炎患者。研究结论本研究综合应用网络药理学和生物信息学等方法,初步揭示了喜炎平注射液和苏合香丸治疗新冠肺炎的活性成分、关键靶点和重要通路,阐释了两种中成药治疗新冠肺炎的作用机制。结果表明,喜炎平注射液治疗新冠肺炎的核心机制可能与抑制细胞因子风暴、调节免疫反应等过程有关。苏合香丸发挥治疗作用的机制可能与降低血管通透性,阻碍病毒入侵和自我复制,调控免疫、炎症反应有关。本研究能够为探索和评价多成分,多靶点,多通路的中成药治疗复杂疾病的作用机制提供参考和思路,同时为临床合理应用喜炎平注射液和苏合香丸治疗新冠肺炎提供科学依据。