球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作为一种虫生真菌,对15个目149个科521个属中的700多种昆虫具有感染能力。正是因为球孢白僵菌所具有的高致病性、高适应性以及宿主范围广泛等特点,近些年其逐渐成为了生物防治的主要角色用以代替化学农药广泛使用。但是由于其具有广泛的宿主范围,家蚕等经济动物也同样会受到白僵菌的浸染从而导致不可挽回的经济损失。因此,对球孢白僵菌的致病机理以及其应对不同宿主时所产生的不同生理活动的研究就显得尤为重要。本实验室前期经过分离鉴定得到了一株在家蚕群体内体现出高毒力的菌株GXsk1011,在对其应对不同昆虫表皮时的转录组学分析中得到了一个在家蚕表皮中低表达而在棉铃虫表皮高表达的基因Bb Chi A2（BBA＿05353）。本研究以该基因作为研究对象,进行了基因克隆以及生物信息学分析,并利用相关基因工程手段构建了该基因的敲除、回补以及过量表达突变株。通过对比各突变株在应对家蚕以及棉铃虫这两个代表性宿主时的差异性来探究球孢白僵菌几丁质酶Bb Chi A2的感染特点。同时,通过毕赤酵母表达系统对该几丁质酶基因进行外源表达,进一步从分子角度来探究该基因表达产物的功能,以及其对昆虫表皮的降解差异。主要研究结果:1.目的基因的克隆及生物学分析提取了球孢白僵菌基因组DNA并通过高保真PCR体系克隆了目的基因BbchiA2。通过相关软件及数据库对BbchiA2基因的生物信息学分析表明,该基因属于糖苷水解酶18家族（GH18）基因,与NCBI数据库中Beauveria bassiana A2860菌株的同源性高达99.01%并且不含内含子。该基因核苷酸总长为1008 bp;编码了35.47 KDa大小的代谢产物;在1-18位氨基酸处含有一个N-端信号肽初步认定该代谢产物为分泌型蛋白;以及在151位氨基酸处含有一个N-糖基化位点。2.突变株的构建分别构建了目的基因BbchiA2的敲除、回补以及超量表达载体,利用农杆菌转化法分别实现了对野生型球孢白僵菌GXs K1011的转化并获得了相应突变株的阳性转化子:ΔBbchiA2（敲除株）、Com BbchiA2（回补株）以及OEBbchiA2（超量表达株）。3.突变株生化性质的比较利用各突变型以及野生型（WT）球孢白僵菌分别进行了菌落形态、生长速率、产孢量、孢子萌发率、抗逆性以及在应对家蚕和棉铃虫时在不同侵染方式上的毒力差异等生理生化探究。结果如下:1)在对菌落形态上的观察发现,较野生株而言敲除株的菌落体现为菌丝短小且向四周扩散;回补株菌落形态与敲除株相似但有少量较长菌丝生长接近于野生株;超量表达菌株则表现出与敲除株和回补株完全不同的表型,其气生菌丝明显长于敲除株以及野生株;2)从产孢量来看,敲除株的产孢量明显高于回补株、野生株以及超量表达株,这当中超量表达株体现出明显的产孢量下降;3)从孢子萌发率（活性）的角度观察发现,超量表达菌株的萌发能力明显高于野生株、敲除株以及回补株。而野生株、敲除株以及回补株之间并没有明显差异;4)从胁迫因子对各突变株的影响来看,超量表达菌株在细胞壁抑制剂刚果红的作用下生长受到了明显的抑制,但敲除株以及回补株在各种胁迫因子的作用下相对于野生株并没有受到抑制反而生长得更好;5)对五龄家蚕以及棉铃虫的体表侵染结果来看,敲除株以及回补株都体现出低于野生株的毒力并且超量表达株在应对家蚕时毒力最弱,即使在孢子浓度在1×10~8conidia/m L时致死率也只有35%左右仍然没有达到50%。但是在应对棉铃虫时超量表达菌株却表现出了高于敲除株以及回补株的毒力,其在孢子浓度为1×10~7conidia/m L时LT50=180 h,当浓度为1×10~8conidia/m L时LT50=144 h。另外,在通过注射的方式侵染家蚕时也体现出了与体壁侵染方式的巨大差异。总体来说通过注射的方式侵染,超量表达菌株的毒力明显高于其它几种菌株,并且野生株的毒力是高于敲除株以及回补株的。超量表达菌株在孢子浓度为1×10~6conidia/m L时LT50=80 h,孢子浓度为1×10~7conidia/m L时LT50=60 h,而在孢子浓度为1×10~8conidia/m L时LT50=40 h。从毒力实验来看,不同突变菌株与不同昆虫体壁之间的互作确实存在差异,这直接影响到菌株对不同昆虫的毒力。4.目的基因的外源表达为进一步探究目的基因BbchiA2对昆虫体壁的作用,利用一步克隆的方法构建了真核表达载体p PIC9K-chi A2,并通过电转化法成功转入毕赤酵母感受态中得到高表达菌株。同时,对表达菌株的发酵条件进行了摸索得到最佳发酵时间为5天以及最佳洗脱液的咪唑浓度为50 m M。最后,通过发酵以及纯化浓缩得到了目的基因BbchiA2的蛋白产物。5.重组蛋白BbchiA2的活性测定对外源表达的蛋白产物进行测定其浓度为3.5 mg/mL,在40℃时表现出了最高的酶活性为45.16 U/g。另外,在对家蚕以及棉铃虫的表皮降解实验中BbchiA2蛋白均表现出了降解作用,最后在以0.01 g表皮为底物的200μL体系中40℃反应1 h后家蚕表皮降解产生的还原糖量为0.823μg,而棉铃虫表皮降解产生的还原糖量为1.554μg,因此,BbchiA2蛋白对棉铃虫的降解作用显著高于对家蚕的降解。综上所述,本研究分别构建了球孢白僵菌几丁质酶BbchiA2基因的敲除株、回补株以及超量表达菌株,并分别探究了各突变株以及野生株之间的生物学表型。敲除菌株对家蚕和棉铃虫的毒力较野生菌株均下降;超量表达菌株对家蚕经表皮感染的毒力显著下降,而对棉铃虫的毒力有所增强;异源真核表达该蛋白作用于表皮,对棉铃虫表皮的降解作用显著高于家蚕表皮。结果显示:几丁质酶家族基因BbchiA2的差异表达调控可能是球孢白僵菌适应不同昆虫表皮感染的一个重要分子机制。