背景脑缺血是中风的一种常见形式,目前仍是导致全球死亡率较高的原因之一。脑缺血后,血管新生和神经新生存在必然的关系,许多研究表明神经新生与血管新生相随。血管内皮生长因子-A（VEGF-A）不仅是一种促血管生成活性的生长因子,也是神经营养因子,对神经细胞具有保护作用。脑缺血后,缺血脑区产生大量VEGF-A,VEGF-A与其受体KDR结合,促进血管新生、神经新生和神经保护。课题组前期研究表明梓醇能促进血管新生、神经元轴突生长,而梓醇是否通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血后血管新生,同时促进神经干细胞增殖、分化、存活,尚不明确。本课题拟采用携带干扰VEGF-A表达的AAV病毒与抑制KDR蛋白的抑制剂SU5416抑制VEGF-A/KDR信号通路,研究梓醇调控脑缺血后血管新生与神经新生的作用机制,并进一步证明梓醇的促血管新生作用能否促进神经干细胞增殖分化为神经元,将血管新生信号与内源性神经新生偶联起来。目的观察梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路对脑缺血大鼠神经行为学、血管新生和神经新生、分化、存活的影响,并进一步证明梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路促进血管新生对神经干细胞增殖分化为神经元的效应和机制。方法在体水平:1.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路对脑缺血大鼠神经功能的影响将SD大鼠随机分为假手术组,模型组,梓醇组（5 mg/kg）,梓醇+SU5416（10mg/kg）组,梓醇+AAV组,梓醇+NC组（空载病毒组）,每组动物至少6只。梓醇+AAV组与梓醇+NC组在造模开始前7天采用脑立体定位注射AAV-VEGF-A病毒或空载NC病毒（由于病毒注射入体内后需要7～14天开始表达）于侧脑室。7天后采用电凝法制备脑缺血模型,给药组给与梓醇腹腔注射5 mg/kg,每日一次,连续给药7天,其余各组给与等量生理盐水。SU5416在造模后第3天开始给药,腹腔注射,10 mg/kg,每日一次。分别在造模0、4、7、10、14天时,进行Bederson评分、m NSS评分,对神经功能进行评价。2.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路对脑缺血后血管新生的影响14天后取材,采用ELISA法检测缺血皮质区蛋白VEGF-A、p-KDR/KDR的表达;免疫荧光法检测缺血皮质区新生血管标志（CD105）,评价梓醇是否通过VEGF-A/KDR信号通路调控脑缺血后血管新生。3.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路对脑缺血后神经新生、分化、存活的影响14天后取材,采用免疫荧光法检测SVZ区神经干细胞（Nestin）,未成熟神经元（DCX）,缺血皮质区和海马DG区成熟神经元（Neu N）与星型胶质细胞（GFAP）的表达,评价梓醇是否通过VEGF-A/KDR信号通路调控脑缺血后神经新生、分化、存活。离体水平:1.神经干细胞与脑微血管内皮细胞的分离培养从新生SD大鼠中分离培养神经干细胞（NSCs）与脑微血管内皮细胞（BMECs）,进行纯化鉴定。采用CCK-8检测梓醇对两种细胞的活性作用、SU5416对两种细胞的抑制作用与OGD作用时间的筛选,筛选出最佳浓度或最佳作用时间。2.梓醇在OGD条件下通过VEGF-A/KDR信号通路对神经干细胞增殖分化的影响免疫荧光双标Brd U与MAP-2观察1、10、100μM梓醇对缺氧条件下神经干细胞的促增殖分化作用。ELISA法检测不同浓度梓醇对神经干细胞VEGF-A蛋白表达的影响。再通过Brd U与MAP-2双标观察使用SU5416抑制VEGF-A/KDR信号通路后,对梓醇促神经干细胞增殖分化作用的影响;WB法检测VEGF-A/KDR信号通路下游蛋白PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白的表达。3.梓醇在OGD条件下通过VEGF-A/KDR信号通路对脑微血管细胞增殖的影响采用Brd U标记增殖的脑微血管内皮细胞,观察1、10、100μM梓醇给药后增殖细胞的数量,ELISA法检测不同浓度梓醇对脑微血管内皮细胞VEGF-A蛋白表达的影响,再通过免疫荧光法观察使用SU5416抑制VEGF-A/KDR信号通路后,对梓醇促脑微血管内皮细胞增殖作用的影响。4.梓醇促血管新生作用在OGD条件下对共培养后神经干细胞增殖分化的影响将脑微血管内皮细胞与神经干细胞采用Transwell小室进行共培养,利用免疫荧光双标Brd U与MAP-2观察共培养对神经干细胞增殖分化为神经元的影响;分别给与脑微血管内皮细胞0、10μM梓醇,100μM SU5416或梓醇+SU5416,再将已经通过不同药物处理后的脑微血管内皮细胞与神经干细胞在Transwell小室中共培养,以研究梓醇促脑微血管内皮细胞增殖作用对神经干细胞增殖分化为神经元的影响。结果在体水平:1.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血大鼠神经功能恢复Bederson与m NSS评分结果:0天,各组大鼠的评分相较假手术组有显著性差异（P＜0.01）,提示模型制备成功与模型制备的稳定性。4到14天,随着时间的延长,各组大鼠评分均降低,提示有自发恢复的可能,但梓醇组较模型组评分显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,提示梓醇能够促进大鼠神经功能的恢复。梓醇+SU5416组、梓醇+AAV组与梓醇组相比评分显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,提示在抑制VEGF-A/KDR信号通路后,梓醇促进大鼠神经功能恢复作用显著降低。2.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血后血管新生ELISA结果:与模型组相比,梓醇组VEGF-A与p-KDR/KDR的表达显著增加（P＜0.05）。与梓醇组相比,梓醇+SU5416组p-KDR/KDR的表达显著降低（P＜0.01）,梓醇+AAV组VEGF-A与p-KDR/KDR的表达显著降低（P＜0.01）。免疫荧光结果:与假手术组相比,模型组CD105有一定的增加,但无显著性差异（P＞0.05）;与模型组相比,梓醇组CD105的表达显著增加（P＜0.01）,提示梓醇能促进脑缺血后血管新生。与梓醇组相比,梓醇+SU5416组与梓醇+AAV组CD105的表达显著降低（P＜0.01）,提示在抑制VEGF-A/KDR信号通路后,梓醇促脑缺血后血管新生作用被显著抑制。3.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血后神经新生、分化、存活免疫荧光结果:SVZ区神经干细胞Nestin,模型组较假手术组显著增加（P＜0.05）,梓醇组较模型组显著增加（P＜0.01）,梓醇+SU5416组、梓醇+AAV组较梓醇组显著降低（P＜0.05）。SVZ区未成熟神经元DCX,模型组较假手术组呈增高趋势,无显著性差异（P＞0.05）,梓醇组较模型组显著增加（P＜0.05）,梓醇+SU5416组、梓醇+AAV组较梓醇组显著降低（P＜0.05）。缺血皮质区成熟神经元Neu N,模型组较假手术组显著降低（P＜0.01）,梓醇组较模型组显著增加（P＜0.01）,梓醇+SU5416组、梓醇+AAV组较梓醇组显著降低（P＜0.01）。海马DG区成熟神经元Neu N,模型组较假手术组显著降低（P＜0.01）,梓醇组较模型组显著增加（P＜0.05）,梓醇+SU5416组较梓醇组成熟神经元的数量呈降低趋势（P＞0.05）,梓醇+AAV组较梓醇组成熟神经元的数量显著降低（P＜0.05）。缺血皮质区和海马DG区星型胶质细胞GFAP,模型组较假手术组显著性增加（P＜0.01）,梓醇组较模型组显著性降低（P＜0.01）,梓醇+SU5416组、梓醇+AAV组较梓醇组显著增加（P＜0.01）。提示梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路可以促进SVZ区神经干细胞、未成熟神经元增殖,保护缺血皮质区与海马DG区成熟神经元存活,抑制缺血皮质区与海马DG区星型胶质细胞过度增殖。离体水平:1.成功分离培养神经干细胞与脑微血管内皮细胞成功分离培养脑微血管内皮细胞与神经干细胞。经过CCK-8筛选,后续实验选用1、10、100μM梓醇进行给药,对于脑微血管内皮细胞,SU5416选择浓度为100μM,对于神经干细胞,SU5416选择浓度为50μM,OGD条件确定为4 h。2.梓醇在OGD条件下通过VEGF-A/KDR信号通路促进神经干细胞增殖分化为神经元1、10、100μM梓醇组与OGD组相比,Brd U/MAP-2双标数量显著增加（P＜0.01）,VEGF-A的表达显著增加（P＜0.05）,提示梓醇可以促进VEGF-A表达与促进神经干细胞增殖分化为神经元。梓醇+SU5416组与梓醇组相比Brd U/MAP-2双标数量显著降低（P＜0.01）,提示抑制VEGF-A/KDR信号通路后,梓醇促神经干细胞增殖分化为神经元作用被显著抑制。WB结果表明,梓醇促进OGD后PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白的表达,给与SU5416抑制VEGF-A/KDR信号通路后,下游蛋白的表达显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。3.梓醇在OGD条件下通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑微血管内皮细胞增殖1、10、100μM梓醇组与OGD组相比,Brd U数量显著增加（P＜0.01）,VEGF-A的表达显著增加（P＜0.05或P＜0.01）,提示梓醇可以促进VEGF-A表达与脑微血管内皮细胞增殖。梓醇+SU5416组与梓醇组相比Brd U数量显著降低（P＜0.01）,提示抑制VEGF-A/KDR信号通路后,梓醇促脑微血管内皮细胞增殖作用被显著抑制。4.梓醇促血管新生作用在OGD条件下促进共培养后神经干细胞增殖分化为神经元将脑微血管内皮细胞与神经干细胞共培养,共培养组与神经干细胞组相比,Brd U/MAP-2双标数量显著增加（P＜0.01）,提示共培养可以促进神经干细胞增殖分化为神经元。不同药物处理后的脑微血管内皮细胞与神经干细胞共培养结果表明,梓醇组与OGD组相比Brd U/MAP-2双标数量显著增加（P＜0.01）,梓醇+SU5416组与梓醇组相比显著降低（P＜0.01）,与SU5416组相比显著增加（P＜0.05）,提示梓醇促血管新生作用可以促进神经干细胞增殖分化为神经元。结论1.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血大鼠神经功能恢复,降低Bederson评分与m NSS评分。2.梓醇促进脑缺血后VEGF-A、p-KDR/KDR表达,并通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血后血管新生。3.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路促进脑缺血后SVZ区神经干细胞与未成熟神经元的增殖,有利于缺血脑区与海马DG区神经元的存活,同时抑制星形胶质细胞过度增生,促进缺血脑区的恢复。4.梓醇通过VEGF-A/KDR信号通路直接促进OGD后脑微血管内皮细胞增殖与神经干细胞增殖分化为神经元,并间接通过促脑微血管内皮细胞增殖作用诱导神经干细胞增殖分化为神经元。