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[研究背景]
子痫前期(preeclampsia,PE)是发生在妊娠期间特有的一种高血压综合征，以高血压、蛋白尿为其特征。它是孕产妇及围产儿发病及死亡的重要原因之一，特别是在发展中国家更为严重。虽然众多国内外学者对其发病机制进行了大量研究，但相关的具体发病机理至今仍未得到完全阐明，亦无明确有效的防治手段，临床上一般只能采用终止妊娠的方法治疗，而过早的终止妊娠又必将导致新生儿的患病率和死亡率的升高。大量现有的研究均表明：早发子痫前期较晚发子痫前期而言，病情更严重，母儿预后更差。因此，能够对早发子痫前期作出早期诊断、预防就显得十分重要。
表观遗传学通过近年来众多研究表明：其在子痫前期的发病中可能起到重要作用。最早发现的表观遗传修饰方式之一--DNA甲基化，也是目前子痫前期领域研究的热点。大量研究表明子痫前期与正常妊娠相较而言，胎盘乃至母体外周血中DNA甲基化情况存在差别，这些差异甲基化的存在可能在子痫前期发病机制上起到一定的作用。本研究通过高通量甲基化芯片对早发子痫前期与正常对照组甲基化位点进行筛选分析后挑出最具差异的相应基因，通过克隆测序检测目的基因的目标位点甲基化情况以探讨该基因在早发子痫前期的发病中可能发挥着的作用。
第一部分高通量芯片筛选早发子痫前期特异性甲基化位点
[目的]
通过对早发子痫前期及相应孕周对照组孕妇胎盘组织全基因组甲基化情况的对比，寻找早发子痫前期DNA甲基化水平显著变化的基因，发现差异甲基化位点，并进行功能富集分析以探讨其在早发子痫前期发生、发展过程中所发挥的作用。为后续研究早发子痫前期特异性甲基化位点做准备。
[方法]
1.选取2015年3月至2016年3月在广东省妇幼保健院分娩的妇女6例，其中，早发子痫前期孕妇3例，与之孕周对应的早产孕妇3例。在其分娩时取其胎盘组织。
2.提取胎盘组织DNA,进行重亚硫酸盐甲基化处理，WGA扩增甲基化后的DNA、片段化处理，芯片杂交、洗脱、延伸、成像。
3.通过对芯片数据的分析，筛选出差异甲基化基因，并分析这些基因与早发子痫前期可能的关联性。
[结果]
1.早发子痫前期与其对照组间发现3112个差异甲基化位点(我们定义一个基因至少出现两条阳性探针为高度甲基化，那么本次研究中共有23个基因为高甲基化基因)。
2.GO分析显示差异表达基因在调节离子跨膜转运，GTP酶的正调节；质膜及细胞连接；钙调蛋白结合，免疫炎症反应，细胞表面受体相关信号传导，细胞粘附，等生物途径显著富集。差异基因的Pathway分析，共有8种差异甲基化基因通路，见表1.1。这些基因通路主要集中在造血细胞系、内吞作用、细胞粘附、免疫系统和碳水化合物代谢等方面，见图1.6。
3.WNT2基因阳性探针为10(总探针数为20)，是所有阳性探针数之最。我们猜测该基因可能为早发子痫前期特异性基因。
[结论]
1.早发子痫前期与其对照组的胎盘组织DNA的甲基化情况存在着显著差异，这与其他人的研究结论一致。
2.早发子痫前期在细胞表面受体相关信号传导，细胞粘附，母体妊娠和血管生成等生物途径的基因与其对照组比较，表现为高甲基化。
3.WNT2基因可能作为早发子痫前期发生机制和早期分子诊断的候选基因，本文第二部分对此进行进一步验证。
第二部分甲基化克隆测序验证WNT2基因在早发子痫前期中高甲基化
[目的]
验证实验的第一部分发现的可能为早发子痫前期的特异性基因-WNT2基因，在早发子痫前期与其对照组胎盘组织中的甲基化情况是否具有统计学差异。探讨WNT2基因在早发子痫前期发病中的可能作用机制。
[方法]
1.选取2015年3月至2016年3月在广东省妇幼保健院分娩的妇女20例，其中，早发子痫前期10例，与之孕周对应的早产孕妇10例。在其分娩时取其胎盘组织。
2.Hs-PCR扩增第一部分中甲基化后的DNA，DNA胶回收；链接PMD18-Tvector转染至感受态细菌，摇菌、涂板、取单菌落、摇菌、菌液PCR、菌液PCR产物电泳、测序。比较两组样本的甲基化率。
3.运用SPSS19.0软件对两组样本的基本临床信息以及甲基化率进行统计学分析。
[结果]
1.早发子痫前期组和对照组的临床特征如表2.1所示。两组研究对象的年龄、孕前体重指数、孕周、胎盘重量和新生儿体重未见统计学差异。在早发子痫前期组和对照组的孕妇收缩压和舒张压有差异。
2.在早发子痫前期组中，WNT2基因中407位点的甲基化率为77%，409位点甲基化率为78%；而对照组中407位点甲基化率为5%，409位点甲基化率为5%；这两个位点的甲基化率具有显著的统计学差异。
[结论]
1.早发子痫前期与其对照组的胎盘组织WNT2基因两目标位点的甲基化率存在差异，早发子痫前期WNT2中两目标位点高甲基化。
2.WNT2基因可能作为早发子痫前期发生机制和早期分子诊断的候选基因，需要进行进一步验证和深入研究。
子痫前期(preeclampsia,PE)是发生在妊娠期间特有的一种高血压综合征，以高血压、蛋白尿为其特征。它是孕产妇及围产儿发病及死亡的重要原因之一，特别是在发展中国家更为严重。虽然众多国内外学者对其发病机制进行了大量研究，但相关的具体发病机理至今仍未得到完全阐明，亦无明确有效的防治手段，临床上一般只能采用终止妊娠的方法治疗，而过早的终止妊娠又必将导致新生儿的患病率和死亡率的升高。大量现有的研究均表明：早发子痫前期较晚发子痫前期而言，病情更严重，母儿预后更差。因此，能够对早发子痫前期作出早期诊断、预防就显得十分重要。
表观遗传学通过近年来众多研究表明：其在子痫前期的发病中可能起到重要作用。最早发现的表观遗传修饰方式之一--DNA甲基化，也是目前子痫前期领域研究的热点。大量研究表明子痫前期与正常妊娠相较而言，胎盘乃至母体外周血中DNA甲基化情况存在差别，这些差异甲基化的存在可能在子痫前期发病机制上起到一定的作用。本研究通过高通量甲基化芯片对早发子痫前期与正常对照组甲基化位点进行筛选分析后挑出最具差异的相应基因，通过克隆测序检测目的基因的目标位点甲基化情况以探讨该基因在早发子痫前期的发病中可能发挥着的作用。
第一部分高通量芯片筛选早发子痫前期特异性甲基化位点
[目的]
通过对早发子痫前期及相应孕周对照组孕妇胎盘组织全基因组甲基化情况的对比，寻找早发子痫前期DNA甲基化水平显著变化的基因，发现差异甲基化位点，并进行功能富集分析以探讨其在早发子痫前期发生、发展过程中所发挥的作用。为后续研究早发子痫前期特异性甲基化位点做准备。
[方法]
1.选取2015年3月至2016年3月在广东省妇幼保健院分娩的妇女6例，其中，早发子痫前期孕妇3例，与之孕周对应的早产孕妇3例。在其分娩时取其胎盘组织。
2.提取胎盘组织DNA,进行重亚硫酸盐甲基化处理，WGA扩增甲基化后的DNA、片段化处理，芯片杂交、洗脱、延伸、成像。
3.通过对芯片数据的分析，筛选出差异甲基化基因，并分析这些基因与早发子痫前期可能的关联性。
[结果]
1.早发子痫前期与其对照组间发现3112个差异甲基化位点(我们定义一个基因至少出现两条阳性探针为高度甲基化，那么本次研究中共有23个基因为高甲基化基因)。
2.GO分析显示差异表达基因在调节离子跨膜转运，GTP酶的正调节；质膜及细胞连接；钙调蛋白结合，免疫炎症反应，细胞表面受体相关信号传导，细胞粘附，等生物途径显著富集。差异基因的Pathway分析，共有8种差异甲基化基因通路，见表1.1。这些基因通路主要集中在造血细胞系、内吞作用、细胞粘附、免疫系统和碳水化合物代谢等方面，见图1.6。
3.WNT2基因阳性探针为10(总探针数为20)，是所有阳性探针数之最。我们猜测该基因可能为早发子痫前期特异性基因。
[结论]
1.早发子痫前期与其对照组的胎盘组织DNA的甲基化情况存在着显著差异，这与其他人的研究结论一致。
2.早发子痫前期在细胞表面受体相关信号传导，细胞粘附，母体妊娠和血管生成等生物途径的基因与其对照组比较，表现为高甲基化。
3.WNT2基因可能作为早发子痫前期发生机制和早期分子诊断的候选基因，本文第二部分对此进行进一步验证。
第二部分甲基化克隆测序验证WNT2基因在早发子痫前期中高甲基化
[目的]
验证实验的第一部分发现的可能为早发子痫前期的特异性基因-WNT2基因，在早发子痫前期与其对照组胎盘组织中的甲基化情况是否具有统计学差异。探讨WNT2基因在早发子痫前期发病中的可能作用机制。
[方法]
1.选取2015年3月至2016年3月在广东省妇幼保健院分娩的妇女20例，其中，早发子痫前期10例，与之孕周对应的早产孕妇10例。在其分娩时取其胎盘组织。
2.Hs-PCR扩增第一部分中甲基化后的DNA，DNA胶回收；链接PMD18-Tvector转染至感受态细菌，摇菌、涂板、取单菌落、摇菌、菌液PCR、菌液PCR产物电泳、测序。比较两组样本的甲基化率。
3.运用SPSS19.0软件对两组样本的基本临床信息以及甲基化率进行统计学分析。
[结果]
1.早发子痫前期组和对照组的临床特征如表2.1所示。两组研究对象的年龄、孕前体重指数、孕周、胎盘重量和新生儿体重未见统计学差异。在早发子痫前期组和对照组的孕妇收缩压和舒张压有差异。
2.在早发子痫前期组中，WNT2基因中407位点的甲基化率为77%，409位点甲基化率为78%；而对照组中407位点甲基化率为5%，409位点甲基化率为5%；这两个位点的甲基化率具有显著的统计学差异。
[结论]
1.早发子痫前期与其对照组的胎盘组织WNT2基因两目标位点的甲基化率存在差异，早发子痫前期WNT2中两目标位点高甲基化。
2.WNT2基因可能作为早发子痫前期发生机制和早期分子诊断的候选基因，需要进行进一步验证和深入研究。