论文部分内容阅读
研究背景:急性胰腺炎肺损伤（Acute pancreatitis-associated lung injury,APALI）是重症急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis SAP）最常见且最严重的早期并发症。APALI病理变化极其复杂,其临床治疗一直处于多学科交叉探索之中。目前学者们普遍认为全身炎症反应释放的炎性介质导致肺泡上皮细胞广泛损伤,富含蛋白的水肿液渗入肺间质和肺泡腔,引发急性肺水肿、肺不张及远期的肺纤维化是APALI发生发展的重要机制。其中不可控的炎症反应是其发生发展的最重要的因素之一。SAP导致局部炎症,坏死组织和细胞释放多种炎症介质,肠道屏障功能障碍,内毒素释放,维持和放大炎症级联反应,导致严重的SIRS。在ALI发病过程中,肺受到刺激后,巨噬细胞立即向M1表型极化,作为抵御损伤的第一道防线,释放多种促炎和有害介质,从而促进中性粒细胞在肺内的聚集。众所周知,促炎细胞因子和中性粒细胞的过度积累参与了炎症性疾病中组织损伤的病理生理过程。因此,巨噬细胞在肺组织损伤过程中起始动作用。课题组前期研究发现SAP大鼠巨噬细胞被激活通过分泌趋化因子CXCL1进而促进中性粒细胞向肺组织内浸润,引起APALI。提示肺巨噬细胞在APALI的发展过程中发挥了重要作用。线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）是存在于线粒体内的双链环状DNA。近年来,越来越多的证据表明,mtDNA可以被免疫系统识别并直接调节免疫反应,激活下游干扰素基因刺激因子（stimulatorofinterferongenes,STING）,从而激活NF-κB信号通路介导促炎介质的表达。在急性胰腺炎过程中,STING.及其下游信号通路激活,促进炎症的发生发展。然而,mtDNA-STING信号通路在急性胰腺炎肺损伤过程的作用却鲜有研究。本课题组长期致力于研究骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）对APALI的治疗机制。BMSC是来源于骨髓的一类多能干细胞,是理想的细胞治疗、组织工程和基因治疗的靶细胞,具有广泛的应用前景。我们课题组前期结果和相关研究表明,经尾静脉注射的BMSC能够通过SDF-1/CXCR4轴归巢到肺部,有效的抑制肺部炎症,改善肺损伤。BMSC主要通过旁分泌机制,将多种效应物质传递给损伤部位,发挥强大的免疫调节功能来抑制肺部炎症反应,改善肺损伤。但是BMSC能否通过减轻线粒体损伤,抑制STING-NF-κB信号通路减轻巨噬细胞炎症,改善急性胰腺炎肺损伤,目前尚无相关研究报道。因此,本研究拟通过建立急性胰腺炎大鼠模型及巨噬细胞炎症模型,探讨BMSC能否通过调控mtDNA-STING-NF-κB信号通路,改善急性胰腺炎肺损伤。方法:实验一:首先建立APALI模型。将20只SPF级健康成年雄性大鼠随机分为2组（每组10只）:假手术组（Sham组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）。通过向雄性SD大鼠经胆胰管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠的方法制备急性胰腺炎肺损伤动物模型,对照组仅开腹翻动数次胰腺。术后48h取材,检测指标包括:（1）HE染色观察胰腺及肺组织病理变化。（2）ELISA检测血清淀粉酶的改变。（3）血气分析研究肺通气和氧合改变。实验二:基于APALI模型,研究BMSC对APALI治疗作用。40只SPF级健康成年雄性大鼠随机分为4组（每组10只）:假手术组（Sham组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）、地塞米松处理组（DEX组）、BMSC处理组（BMSC组）。BMSC组和DEX组术后4h分别给予BMSC尾静脉注射（106cells/只）,地塞米松腹腔注射（10mg/kg）,术后48h取材。检测指标包括:（1）HE染色观察胰腺及肺组织病理变化。（2）血气分析探究肺通气及氧合改变。（3）ELISA检测炎症因子IL-6水平。（4）Western blot检测炎症因子TNF-α蛋白表达。实验三:应用RAW264.7巨噬细胞系,给予500ng/mL的LPS构建巨噬细胞炎症模型;0.4μm Transwell小室上层接种BMSC,下层六孔板接种RAW264.7巨噬细胞,构建共培养模型,研究BMSC对巨噬细胞的调控作用。实验分组:正常对照组（Control组）,共培养对照组（Control+BMSC组）,LPS刺激组（LPS组）,共培养LPS刺激组（LPS+BMSC组）。检测指标包括:（1）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测炎症因子TNF-α,IL-6,IL-1β的mRNA表达。（2）通过线粒体分离试剂盒分离RAW264.7细胞线粒体与胞浆,检测胞质内mtDNA的表达。（3）Western blot 检测 STING 信号通路相关蛋白 p-STING、STING、NF-κB p-P65、NF-κB P65 的表达。结果:1.成功建立大鼠急性胰腺炎肺损伤模型。（1）HE染色结果显示:SAP大鼠术后胰腺出现大量炎性细胞浸润,胰腺小叶水肿伴间隙增宽,间质内血管明显扩张伴出血;肺泡及间质明显水肿,肺泡间隔增宽,局灶性肺不张,大量炎症细胞浸润,血管扩张伴充血出血。（2）ELISA结果显示:SAP组血清淀粉酶升高。（3）血气分析结果显示:SAP组大鼠术后PH值和PaO2降低,PaCO2升高。2.BMSC可以减轻急性胰腺炎肺损伤。（1）解剖形态结果显示:SAP大鼠术后可见腹腔血性腹水,胰腺肿胀坏死并出现出血点及皂化斑;给予地塞米松或BMSC后明显好转。（2）HE染色结果显示:SAP大鼠术后胰腺出现大量炎性细胞浸润,胰腺小叶水肿伴间隙增宽,间质内血管明显扩张伴出血;肺泡及间质明显水肿,肺泡间隔增宽,局灶性肺不张,大量炎症细胞浸润,血管扩张伴充血出血。给予地塞米松或BMSC后明显好转。（3）血气分析结果显示:SAP大鼠术后PH值明显降低,PaCO2显著升高,给予地塞米松或BMSC后PH值与PaCO2回复至正常水平。（4）ELISA结果表明:SAP大鼠术后炎症因子IL-6水平升高,给予地塞米松或BMSC后炎症因子IL-6水平下降;WB结果显示SAP大鼠术后炎症因子TNF-α表达显著提高,给予地塞米松或BMSC后TNF-α表达显著降低。3.BMSC可以抑制mtDNA-STING-NF-κB信号通路,抑制RAW264.7巨噬细胞炎症反应。（1）RT-qPCR结果显示:LPS刺激后,RAW264.7巨噬细胞炎症因子TNF-α,IL-6,IL-1β的mRNA表达显著提高;与BMSC共培养后,RAW264.7巨噬细胞炎症因子TNF-α,IL-6,IL-1β的mRNA表达显著下降。（2）PCR结果显示:LPS刺激后,RAW264.7巨噬细胞胞质mtDNA水平显著提高;与BMSC共培养后,RAW264.7巨噬细胞胞质mtDNA水平显著下降,（3）WB 结果显示:LPS 刺激后,RAW264.7 巨噬细胞 p-STING、STING、NF-κB p-P65蛋白表达显著提高;与BMSC共培养后,p-STING、STING、NF-κB p-P65蛋白表达显著下降。结论:1.BMSC可以减轻3.5%牛磺胆酸钠诱导的大鼠急性胰腺炎肺损伤,减少胰腺及肺组织坏死,改善肺部通气与氧合,显著减轻肺部炎症。2.BMSC可以抑制LPS刺激激活的mtDNA-STING-NF-κB信号通路,抑制巨噬细胞炎症反应。