【摘 要】
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背景:在我国乳腺癌是发病率非常高的恶性肿瘤之一,而且发病率正在呈逐年上升趋势。引起乳腺癌的发病的因素较多,至今还没有完全的阐述清楚。目前,乳腺癌虽然已有多种治疗手段,然而治疗效果却不是特别理想,临床一线的化疗药物对乳腺癌的治疗效果仍然有限,且容易产生耐药性。因此,开发新的治疗药物成为目前乳腺癌治疗的首要任务之一。土木香内酯（Alantolactone,ALT）是从土木香根茎中分离得到的一种倍半萜内
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背景:在我国乳腺癌是发病率非常高的恶性肿瘤之一,而且发病率正在呈逐年上升趋势。引起乳腺癌的发病的因素较多,至今还没有完全的阐述清楚。目前,乳腺癌虽然已有多种治疗手段,然而治疗效果却不是特别理想,临床一线的化疗药物对乳腺癌的治疗效果仍然有限,且容易产生耐药性。因此,开发新的治疗药物成为目前乳腺癌治疗的首要任务之一。土木香内酯（Alantolactone,ALT）是从土木香根茎中分离得到的一种倍半萜内酯。已有研究报道,土木香内酯具有多种生物学作用,包括抗炎和抗氧化功能等。近年来,国内外还有研究报道它能抑制几种类型的癌症,包括胃癌、胰腺癌和肺癌等。然而,ALT的这些抗癌作用确切机制尚需进一步研究。目的:本实验旨在研究土木香内酯在诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的过程中,癌细胞内过氧化损伤的产生、线粒体膜电位的变化,以及PIK/AKT信号通路中相关蛋白的变化来探讨土木香内酯诱导MCF-7细胞凋亡的作用机制,为临床一线乳腺癌的治疗提供新的用药策略。方法:1、体外培养乳腺癌MCF-7细胞。2、MTT细胞增殖率检测实验检测不同浓度ALT对乳腺癌MCF-7细胞增殖能力的影响。3、光学显微镜下观察加入不同浓度土木香内酯时MCF-7细胞的形态变化。4、细胞生存率实验检测加入木香内酯时对MCF-7细胞的生长抑制率。5、Hoechst 33258细胞核染色实验验证加入土木香内酯时MCF-7细胞凋亡的比例。6、流式细胞术测定ALT对MCF-7细胞凋亡的比例的影响。7、细胞内活性氧（ROS）试剂盒检测加入土木香内酯时MCF-7细胞内活性氧的生成情况。8、细胞内线粒体膜电位（MMP）试剂盒检测加入土木香内酯时MCF-7细胞内的线粒体膜电位的变化情况。9、细胞内还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）检测试剂盒检测土木香内酯加药时MCF-7细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）以及GSH/GSSG的表达情况。10、Western blotting免疫印迹方法检测土木香内酯加药时乳腺癌MCF-7细胞内PI3K/AKT信号通路相关蛋白Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、Cleaved-PARP、PI3K、P-AKT、AKT等的表达情况。结果:1、MTT方法验证了土木香内酯减低了MCF-7细胞的增殖比例。2、光学显微镜可见:与不加药组对照,加入土木香内酯40μM时,MCF-7细胞的形态发生了显著的固缩、碎裂等凋亡的形态学改变,。3、Hoechst 33258凋亡细胞核染色实验、流式细胞术实验、细胞生存死亡形成实验验证了土木香内酯促进了MCF-7细胞的凋亡。4、细胞内活性氧（ROS）检测试剂盒、细胞内线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒、细胞内GSH和GSSG检测试剂盒检测结果表明:和对照组比较,土木香内酯诱导MCF-7细胞内活性氧生成的产生,降低了MCF-7细胞的内的线粒体膜电位,使GSH/GSSG比率的显著升高。5、Western blotting实验结果显示:土木香内酯对MCF-7细胞内PI3K/AKT信号通路相关蛋白AKT、p-AKT、PI3K起到了显著的抑制磷酸化作用。结论:本研究结果证实了ALT可以通过升高细胞内活性氧,诱导细胞产生过氧化损伤以及抑制PI3K/AKT信号通路相关蛋白磷酸化来抑制乳腺癌细胞的增殖。
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