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抗菌肽(antimicrobial peptides,ABP)作为一种广泛存在于生物界仅需20-60个氨基酸组成的小分子活性肽,在抗细菌和真菌以及病原虫、病毒或肿瘤细胞方而都有明显的作用。为了建立大量获取抗菌肽(antimicrobial peptides,ABP)的简便有效方法,本研究采用分子生物学等方法,构建了可以表达抗菌肽Temporin与GFP融合蛋白的乳腺特异性表达载体,并将其转染到奶山羊乳腺上皮细胞中后,通过G418药物筛选出含有neo抗性基因的转Tem-GFP基因阳性细胞,并筛选获得基因组中整合有中国林蛙抗菌肽基因的奶山羊乳腺上皮细胞。本研究进一步利用该细胞株通过体细胞核移植的方法获得乳腺特异表达抗菌肽的转基因山羊的相关研究提供了科学依据。研究结果与结论如下：1、中国林蛙皮肤抗菌肽基因的克隆：根据GenBank中的中国林蛙皮肤抗菌肽基因mRNA序列(EU624139)设计引物CEal和2CEa,以提取的中国林蛙皮肤总RNA为模板,进行RT-PCR扩增出中国林蛙皮肤抗菌肽的cDNA。将Temporin的PCR产物与pEASY-T3载体连接,构建出T3-Tem-2CEa克隆载体。2、乳腺特异表达载体的构建：以T3-Tem-2CEa为模板利用引物CEa3引入Xbal酶切位点,PCR扩增后连入pEASY-T3载体中构建T3-Tem-CEa3。再利用酶切、连接等分子克隆手段,将GFP片段插入T3-Tem-CEa3载体后,构建T3-Tem-GFP载体。利用Xhol与Sall将Tem-GFP片段切下,与Xhol线性化的pBC-1相连接,连接方向鉴定正确后,即成功构建出含有抗菌肽以及GFP融合基因的pBC-1乳腺特异表达载体。3、转抗菌肽融合蛋白基因的山羊乳腺上皮细胞的筛选与培养：采用阳离子脂质体法转染线性化的重组乳腺特异性表达载体到奶山羊乳腺上皮细胞中,利用G418筛选获得具有neo抗性基因的阳性细胞。4、对阳性细胞的鉴定：将获得的阳性细胞富集后提取细胞基因组,PCR结果表明目的基因已经整合到细胞基因组中,并对阳性细胞株进行相应的细胞生物检测,其中包括将筛选后的阳性细胞测定细胞生长曲线、经过冷冻复苏处理后的生长状态及生长曲线测定、核型分析等,结果均显示转染后细胞状态无异常。综上所述,采用上述方法,成功获得转Tem-GFP融合基因的奶山羊乳腺上皮细胞株。