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目的:多环芳烃类化合物是一类最常见的环境持久性有机污染物,BaP作为其典型代表,可以导致诸多不良女性妊娠结局,绒毛外滋养层细胞适度迁移侵袭能力以及DNA双链断裂损伤后的同源重组修复在诸多女性生殖不良结局中均减弱,诸多研究表明BaP及其终代谢产物BPDE影响对滋养层细胞同源重组修复能力以及侵袭迁移能力的有明显的抑制作用,然而其潜在的分子机制尚不清楚。本文通过研究多环芳烃代表性污染物BaP及其代谢物BPDE对绒毛外滋养层Swan 71细胞侵袭迁移能力以及DNA同源重组修复能力的影响以及潜在分子机制,希望可以为探讨女性生殖毒性研究中不良胚胎发育及妊娠结局的原因提供思路。方法:1.采用高通量测序技术,检测BPDE诱导Swan 71表达的miRNA,并通过细胞生物学方法研究差异microRNA对侵袭迁移的抑制作用。2.MTT法检测BPDE对细胞增值活力的影响;3.划痕实验和Trans-well实验检测BPDE暴露、miRNA转染、lncRNA转染后、以及基因激动剂处理后绒毛膜外滋养层细胞侵袭迁移的影响。4.利用划痕实验检测BPDE暴露、miRNA转染、lncRNA转染后、以及基因激动剂处理后绒毛膜外滋养层细胞迁移能力的影响。5.利用q-RT-PCR和Western-Blot实验检测BPDE暴露、miRNA转染、lncRNA转染后、以及基因激动剂处理后绒毛膜外滋养层细胞侵袭迁移通路基因与同源重组修复通路基因的mRNA和蛋白的表达。6.利用透射电子显微镜检测BPDE暴露后滋养层细胞伪足功能以及核损伤状况。7.利用RNA荧光原位杂交技术检测BPDE暴露以及BRCA1过表达后细胞内lncRNA-lnc-HR的表达量与分布。8.利用细胞免疫荧光技术检测BPDE暴露后与改变lnc-lnc-HR表达水平改变后BRCA1、RAD51、p-BRCA1的在细胞内以及核内的表达量变化。9.利用RIP实验检测同源重组修复基因BRCA1、RAD51、p-BRCA1与lnc-lnc-HR有无直接相互作用。结果:1.第一部分:BPDE对Swan 71侵袭迁移的影响及机制1).MTT实验结果表明BPDE暴露会使Swan 71细胞的细胞活力下降,并且与BPDE的浓度呈剂量依赖关系(P*<0.05)。2).划痕实验与trans-well实验表明,BPDE可以抑制Swan 71细胞的迁移侵袭能力,且与BPDE呈现剂量依赖关系(P**<0.01)。3).透射电镜的结果表明,BPDE暴露可以使Swan 71细胞的伪足数目减少、长度变短(P*<0.05);还会使Swan 71细胞核发生明显损伤,染色质高度凝聚、边缘化,甚至引起细胞核崩解破碎、变形。4).Western-Blot和q-RT-PCR结果显示暴露BPDE后,迁移侵袭相关通路基因PI3K/AKT/CDC42/PAK1的mRNA和蛋白水平,激活该通路活性则可以恢复BPDE对Swan 71细胞的侵袭迁移功能,表明BPDE可通过抑制PI3K/AKT/CDC42/PAK1通路来抑制Swan 71细胞的侵袭迁移功能。5).高通量测序发现BPDE暴露可诱导Swan 71细胞中miR-194-3p表达明显上调,后续的Western-Blot、q-RT-PCR、划痕实验与trans-well实验结果表明,BPDE诱导上调的miR-194-3p可以降低PI3K/AKT/CDC42/PAK1的mRNA和蛋白水平,从而抑制Swan 71细胞的侵袭迁移功能。2.第二部分:BPDE对Swan 71同源重组修复的影响及机制1).Western-Blot以及细胞免疫荧光结果显示,lnc-lnc-HR可以明显上调Swan 71细胞同源重组修复通路关键基因BRCA1、p-BRCA1、RAD51的蛋白表达量以及BRCA1与RAD51在细胞核内的分布(P*<0.05,P**<0.01)。2).高通量测序、q-RT-PCR以及RNA FISH实验表明,BPDE暴露可以减少Swan 71细胞中lnc-HR的表达量,并且减少其在细胞核内的分布(P**<0.01)。3).彗星电泳实验、透射电镜实验与免疫荧光实验结果显示:BPDE可以诱导Swan71细胞DNA双链断裂(P*<0.05,P**<0.01),并且使得同源重组通路基因MRE11/RAD50/NBS1/CtIP/BRCA1/-p-BRCA1的蛋白表达量减少,RAD51的总蛋白表达量随BPDE浓度增大而上升,但其在细胞核的却明显下降,这些结果提示BPDE可以抑制滋养层Swan 71细胞的同源重组修复。4).细胞免疫荧光与RIP实验结果显示,lnc-HR与p-BRCA1、RAD51均有直接结合,BPDE可以减弱lnc-HR与二者的结合;过表达lnc-HR可以恢复p-BRCA1、RAD51在细胞内以及细胞核内的表达量,减少BPDE暴露导致的DNA双链断裂形成。结论:我们发现,BPDE可抑制绒毛膜外滋养层Swan 71细胞的侵袭迁移能力。其潜在的机制为:BPDE诱导Swan 71细胞中miR-194-3p表达的上调,上调的miR-194-3p抑制了侵袭迁移相关通路PI3K/AKT/CDC42/PAK1,从而降低了Swan 71细胞的侵袭迁移能力;此外,BPDE可抑制绒毛膜外滋养层Swan 71细胞DNA双链断裂后同源重组修复能力。BPDE可以下调lncRNA-lnc-HR的mRNA表达量,lnc-HR可以与同源重组基因p-BRCA1以及RAD51直接结合,增强其稳定性以及细胞核内的表达量,BPDE诱导lnc-HR下调,使得p-BRCA1与RAD51的在核内的表达量降低,Swan 71细胞内同源重组修复效率下降,从而使细胞内双链断裂积累增多与细胞功能障碍。本研究观察了多环芳烃终代谢产物BPDE对滋养层Swan 71细胞侵袭迁移能力与同源重组修复能力的影响,并揭示了其内在分子机制,为探讨女性生殖毒性研究中不良胚胎发育及妊娠结局的原因提供了思路。